TPX2在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其對(duì)腦膠質(zhì)瘤進(jìn)程的影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，約占全部腦腫瘤的45～55％。目前，腦膠質(zhì)瘤的治療手段主要包括手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)治療和綜合治療等，盡管近年來上述治療措施已取得長(zhǎng)足進(jìn)步，但由于膠質(zhì)瘤呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，與周圍腦組織無明顯分界且易于復(fù)發(fā)，且療效均不甚理想。新的治療手段如基因治療等雖有望成為治愈膠質(zhì)瘤的途徑之一，但是目前仍缺乏理想可靠的治療靶標(biāo)。因此尋找調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的分子靶標(biāo)，明確其在膠質(zhì)瘤發(fā)病過程中的病理機(jī)制，已

2、成為神經(jīng)外科領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。
　　 本研究擬通過觀察TPX2在不同病理級(jí)別腦膠質(zhì)瘤以及膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中的確切表達(dá)情況，并通過研究TPX2在膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中的異常表達(dá)，研究TPX2在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過程中的功能角色。實(shí)驗(yàn)共分為三個(gè)部分：第一部分，觀察TPX2在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)水平以及與膠質(zhì)瘤病理級(jí)別的相關(guān)性，調(diào)查TPX2的表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤患者生存時(shí)間的關(guān)系；第二部分，觀察TPX2在U251和U87腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中的mRNA和蛋白

3、表達(dá)水平，并調(diào)查TPX2蛋白在U87細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞定位；第三部分，通過RNA干擾的方法抑制TPX2基因在膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，觀察其對(duì)U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞株生長(zhǎng)、增殖、凋亡等細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)程的影響理以及TPX2對(duì)部分周期和腫瘤相關(guān)性蛋白的影響。
　　 因此，探討TPX2參與腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展以及惡變的分子病理機(jī)制，有助于明確膠質(zhì)瘤的惡性生物學(xué)行為及機(jī)理，有望為膠質(zhì)瘤的臨床治療提供新的分子靶標(biāo)。
　　 第一部分人腦膠質(zhì)瘤中TPX2的表

4、達(dá)和臨床病理相關(guān)性及生存分析
　　 目的：研究TPX2在腦膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)水平及其與膠質(zhì)瘤病理級(jí)別的相關(guān)性，TPX2表達(dá)水平同膠質(zhì)瘤患者生存時(shí)間的關(guān)系。
　　 方法：采用免疫組化染色檢測(cè)5例正常腦組織和52例不同級(jí)別腦膠質(zhì)瘤中TPX2的表達(dá)情況。臨床調(diào)查膠質(zhì)瘤患者，利用生存分析檢驗(yàn)TPX2表達(dá)水平同忠者生存時(shí)間的相關(guān)性。然后用實(shí)時(shí)定量RT-PCR和Western blot雜交分別檢測(cè)組織中TPX2蛋白和mRNA在的表達(dá)水

5、平。并分析TPX2表達(dá)水平同膠質(zhì)瘤級(jí)別的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：采用免疫組化法檢測(cè)了5例正常腦組織及52例人腦膠質(zhì)瘤石蠟標(biāo)本中TPX2蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，正常腦膠質(zhì)細(xì)胞TPX2蛋白染色為陰性，絕大部分膠質(zhì)瘤標(biāo)本中可見TPX2蛋白的陽(yáng)性表達(dá)。在大部分其它類型的膠質(zhì)瘤中也可見TPX2蛋白的陽(yáng)性表達(dá)。腦膠質(zhì)瘤的臨床病理級(jí)別與TPX2的表達(dá)強(qiáng)度與腫瘤惡性程度呈正相關(guān)關(guān)系(P＜0.01)；而性別和年齡則無統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異(P＞0.05)

6、。生存分析表明，TPX2免疫組化染色表達(dá)水平同患者生存時(shí)間成負(fù)相關(guān)(p＜0.05)。根據(jù)TPX2的cDNA序列設(shè)計(jì)相應(yīng)引物，應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)TPX2 mRNA在52例不同級(jí)別腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤和5例正常腦組織中的表達(dá)顯示：TPX2 mRNA表達(dá)水平在膠質(zhì)瘤組織中明顯上調(diào)，與正常腦組織相比差別顯著(P＜0.01)。并且，TPX2 mRNA水平在高級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)水平明顯高于低級(jí)別膠質(zhì)瘤，二者相比差異顯著(P＜0.01)同樣，利用Wes

7、tern blot法測(cè)定TPX2蛋白在上述膠質(zhì)瘤組織的表達(dá)，結(jié)果顯示：TPX2蛋白在膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織中表達(dá)明顯上調(diào)，與正常腦組織相比差別顯著(P＜0.01)。TPX2在Ⅲ-Ⅳ級(jí)(高惡度)膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，而在Ⅰ-Ⅱ級(jí)(低惡度)膠質(zhì)瘤中表達(dá)量較低，Ⅲ-Ⅳ級(jí)與Ⅰ-Ⅱ級(jí)TPX2蛋白的表達(dá)量相比較有顯著差異(P＜0.001)。
　　 結(jié)論：TPX2在腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤可見陽(yáng)性表達(dá)。其表達(dá)水平同腦膠質(zhì)瘤的級(jí)別呈明顯相關(guān)，同膠質(zhì)瘤患者的生存時(shí)間呈負(fù)相

8、關(guān)。
　　 第二部分TPX2在U87、U252膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株中的表達(dá)
　　 目的：研究TPX2在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)細(xì)胞系U87和U251中的mRNA、蛋白表達(dá)水平以及TPX2蛋白在U87細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞定位情況。
　　 方法：應(yīng)用RT-PCR法檢測(cè)TPX2在GBM細(xì)胞系U87和U251中的mRNA表達(dá)水平，應(yīng)用細(xì)胞Western blot法研究TPX2在U87和U251細(xì)胞系中的蛋白表達(dá)水平。應(yīng)用免疫熒光染

9、色，共聚焦顯微鏡系統(tǒng)檢測(cè)TPX2蛋白在U87細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)及亞細(xì)胞定位情況。
　　 結(jié)果： RT-PCR結(jié)果提示TPX2 mRNA表達(dá)水平在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87和U251中明顯上調(diào)，與正常腦組織相比差別顯著(P＜0.05)。Western blot法測(cè)定TPX2蛋白在U87和U251細(xì)胞系中的表達(dá)，結(jié)果表明：二者TPX2蛋白水平明顯高于正常腦組織。免疫熒光染色顯示，TPX2蛋白定位于U87細(xì)胞核內(nèi)，并且同細(xì)胞核內(nèi)紡錘體密切相關(guān)。

10、r>　　 結(jié)論：TPX2位于細(xì)胞核內(nèi)，且在GBM細(xì)胞中其mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯高于正常腦組織。
　　 第三部分TPX2異常表達(dá)對(duì)U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和凋亡的作用以及對(duì)部分細(xì)胞周期相關(guān)性蛋白的影響
　　 目的：研究通過RNA干擾抑制TPX2基因后對(duì)U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞株生長(zhǎng)、增殖、凋亡的作用。
　　 方法：利用RNA干擾抑制U87細(xì)胞株內(nèi)TPX2的表達(dá)。觀察細(xì)胞生長(zhǎng)，3H-TdR同位素滲透法測(cè)定細(xì)胞增殖。流

11、式細(xì)胞儀及Hoechst33258染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡測(cè)定細(xì)胞凋亡。RT-PCR和Western blot測(cè)定TPX2異常表達(dá)的細(xì)胞株AuroraA、Ran、p53、Cyclin D1、Cyclin B1、c-Myc等mRNA和蛋白表達(dá)水平變化。
　　 結(jié)果：轉(zhuǎn)染TPX2 siRNA可有效導(dǎo)致U87細(xì)胞內(nèi)的TPX2表達(dá)。抑制了TPX2表達(dá)的細(xì)胞株同未轉(zhuǎn)染組相比，其生長(zhǎng)、增殖明顯降低(p均＜0.01)。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，TPX2 si

12、RNA轉(zhuǎn)染后U87的凋亡率較對(duì)照組明顯增加(p＜0.01)。U87細(xì)胞內(nèi)TPX2表達(dá)抑制后，AuroraA和Ran cyclin B1 mRNA表達(dá)均較對(duì)照明顯降低，而p53和c-MycmRNA表達(dá)均明顯增加，cyclin D1的mRNA表達(dá)無顯著變化。同樣，在Western blot實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)上訴蛋白表達(dá)同樣有類似結(jié)果。
　　 結(jié)論：TPX2可促進(jìn)GBM細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、侵襲，并導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡減少。敲除TPX2表達(dá)可促進(jìn)