PTTG1在腦膠質(zhì)瘤中的表達和microRNA靶向抑制PTTG1對腦膠質(zhì)瘤細胞生物學特性影響的實驗研究.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，為探討PTTG1基因在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用,本課題通過對膠質(zhì)瘤中PTTG1表達與膠質(zhì)瘤惡性程度、腫瘤細胞增殖活性及其相互關(guān)系進行了研究,并通過體內(nèi)、體外試驗探討PTTG1基因作為基因治療膠質(zhì)瘤優(yōu)選靶的之一的可行性；初步探討PTTG1基因影響腦膠質(zhì)瘤生物學特性的可能機制。 1、人腦膠質(zhì)瘤中PTTG1的表達和臨床病理相關(guān)性分析 采用實時熒光定量RT-PCR方法和Western blo

2、t雜交檢測PTTG1 mRNA和蛋白在正常腦組織、膠質(zhì)瘤和惡性人腦膠質(zhì)瘤細胞系的表達。結(jié)果表明：在正常腦組織中未檢測到PTTG1 mRNA和蛋白的表達；在各級膠質(zhì)瘤中均有PTTG1的表達,其表達強度與腫瘤惡性程度呈正相關(guān)關(guān)系；在Ⅲ-IV級(高惡度)膠質(zhì)瘤中高表達,而在Ⅱ級(低惡度)膠質(zhì)瘤中表達量較低,Ⅲ-IV級與Ⅱ級PTTG1 mRNA、蛋白的表達量相比較有顯著差異(P<0.001)。采用免疫組化ABC法檢測了4例正常腦組織及52例人腦

3、膠質(zhì)瘤石蠟標本中PTTG1蛋白的表達情況。結(jié)果顯示,正常腦膠質(zhì)細胞中基本無PTTG1蛋白的表達,絕大部分星形細胞瘤標本中可見PTTG1蛋白的陽性表達,其表達情況為：Ⅱ級55％(11/20),Ⅲ級76.2％(11/15),IV級100％(17/17)。在II、Ⅲ和IV級3個不同病理級別的星形細胞腫瘤中,PTTG1蛋白的陽性表達率有顯著差別(P<0.01)。大部分其它類型的膠質(zhì)瘤中也可見PTTG1蛋白的陽性表達,其表達情況為：少突膠質(zhì)細胞瘤

4、75％(3/4),室管膜瘤100％(4/4)。腦膠質(zhì)瘤的臨床病理級別、分化程度與PTTG1的表達陽性率之間比較有統(tǒng)計學上的顯著差異性(P<0.01);而性別和年齡則無統(tǒng)計學上的差異(P>0.05)。用Ki-67標記指數(shù)(Ki-67 LabelingIndex)評價膠質(zhì)瘤的增殖活性,基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)對于腫瘤的侵襲具有極其重要的作用。本實驗以免疫組化法檢測了Ki-67、MMP2和

5、MMP9的表達強度,Ki67 LI檢驗三種病理級別膠質(zhì)瘤Ki67表達情況,其表達情況為:Ⅱ級(1.88),Ⅲ級(8.94),Ⅳ級(13.77),統(tǒng)計學上有差異(P<0.001),說明Ki67 LI在不同級別的膠質(zhì)瘤中具有顯著性差異。39例膠質(zhì)瘤中MMP2、MMP9蛋白陽性表達率分別是:Ⅱ級的纖維型星形細胞瘤陽性表達45％、40％,Ⅲ級的間變型星形細胞瘤80％、86.7％,Ⅳ級的多形性膠質(zhì)母細胞瘤均為100％,統(tǒng)計學上有差異(P<0.01

6、)。膠質(zhì)瘤中Ki-67LI、MMP2、MMP9的表達與PTTG1基因表達、腫瘤分級呈正相關(guān),結(jié)果提示膠質(zhì)瘤中PTTG1基因表達與腫瘤細胞增殖活性、侵襲性密切相關(guān)。 2、microRNA靶向性抑制PTTG1表達對人腦膠質(zhì)瘤細胞體外增殖、凋亡以及侵襲性的影響 利用兩個惡性膠質(zhì)瘤體外細胞系U251和SHG-44為模型,將含靶向PTTG1的microRNA(miRNA)的質(zhì)粒pcDNAmTM6.2-GW/EmGFPmiR通過Li

7、pofectamine介導分別轉(zhuǎn)染U251人腦膠質(zhì)母細胞瘤細胞和SHG-44惡性星形細胞瘤細胞,通過熒光定量PCR、Western blot、激光共聚焦顯微鏡、MTT法、流式細胞術(shù)(FCM)以及Caspase-3檢測定性和定量研究了miRNA-PTTG1抑制PTTG1的表達,以及了解對L1251、SHG-44體外細胞增殖、凋亡以及侵襲性的影響。MTT法檢測細胞增殖率,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后的U251、SHG-44細胞克隆生長速度明顯下降。采用FCM

8、定量分析各組細胞的調(diào)亡水平。結(jié)果顯示,與未轉(zhuǎn)染的U251細胞(早期調(diào)亡細胞16.9％)和轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒的U251細胞(早期調(diào)亡細胞14.9％)相比,轉(zhuǎn)染MIR-2干擾質(zhì)粒U251細胞中調(diào)亡細胞明顯增多,48小時后調(diào)亡細胞達20.4％,統(tǒng)計學上有差異(P<0.001);在SHG-44細胞實驗中,與未轉(zhuǎn)染的SHG-44細胞(早期調(diào)亡細胞15.2％)和轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒的SHG-44細胞(早期調(diào)亡細胞14％)相比,轉(zhuǎn)染MIR-2干擾質(zhì)粒SHG-44細

9、胞中調(diào)亡細胞明顯增多,48小時后調(diào)亡細胞達22.2％,統(tǒng)計學上有差異(P<0.001)。Matrigel體外侵襲實驗和細胞遷移運動實驗中,轉(zhuǎn)染miRNA-PTTG1的U251細胞與U251對照組和陰性載體干擾組比較侵襲能力分別下降了36.5％和30％,遷移能力下降了64.2％和64.7％。Western blot分析;miRNA干擾PTTG1在腦膠質(zhì)瘤細胞中表達后,與細胞增殖相關(guān)的蛋白Ki-67、c-myc表達下調(diào)；細胞調(diào)亡相關(guān)的蛋白p

10、53、Bax、p21WAF1/Cipl表達上調(diào)；與腫瘤細胞侵襲性相關(guān)的蛋白MMP2、MMP9表達下降(P<0.05)。研究結(jié)果提示：Lipofectamine-pcDNAm6.2-GW/EmGFPmiR-PTTG1復合物可成功地將針對PTTG1的外源性miRNA導入至膠質(zhì)瘤內(nèi),抑制腫瘤細胞的PTTG1基因表達,對PTTG1 mRNA及蛋白明顯高表達的U251、SHG-44細胞的生長和增殖有明顯的抑制作用,誘導膠質(zhì)瘤細胞調(diào)亡和降低惡性膠質(zhì)

11、瘤細胞的侵襲性。結(jié)果提示PTTG1基因有可能成為基因治療惡性膠質(zhì)瘤的優(yōu)選靶之一。 3、microRNA抑制PTTG1蛋白對人腦膠質(zhì)瘤細胞裸鼠成瘤性的影響 在裸鼠成瘤試驗中,我們將U251細胞(A組),U251+pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR-negative(轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒U251細胞)細胞(B組)和U251+pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR-PTTG1(轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒U251細胞)細胞(C組)分別

12、接種于裸鼠背部皮下,每組5只裸鼠,建立人腦膠質(zhì)瘤裸鼠皮下移植瘤模型。定期觀察腫瘤生長情況,測定腫瘤體積,繪制腫瘤生長曲線,觀察4周后處死動物,稱瘤重。接種4周后,肉眼就可以看到,接種正常U251細胞的腫瘤明顯大于其他兩組。接種正常U251細胞的腫瘤明顯大于其他兩組。4周時測得的各組腫瘤體積分別為:Mock-U251組為(2.36±0.22)cm3;Negative-U251組為(2.06±0.08)cm3;Mir-2-U251組為(1.

13、50±0.05)cm3。處死后,切下3組腫瘤分別稱重,Mock-U251組平均瘤重為(1.71±0.13)g,Negative-U251組為(1.43±0.19)g;Mir-2-U251組為(0.74±0.07)g,結(jié)果顯示,與A組和B組裸鼠相比,C組裸鼠腫瘤形成時間延遲,腫瘤生長緩慢,腫瘤體積及瘤重均明顯減小(P均<0.05)。HE染色顯示各組腫瘤組織符合多形性膠質(zhì)母細胞瘤的形態(tài),靶向抑制PTTG1的miRNA干擾治療后出現(xiàn)了腫瘤中心

14、壞死,壞死區(qū)細胞稀疏,向外細胞漸增多,其間含有很多的破碎細胞,再向外則為密集的瘤細胞,并有細胞內(nèi)、外的水腫和出血,同時也有不同程度的核固縮細胞。Westernblot檢測顯示,與A組和B組相比,C組裸鼠腫瘤組織中活性的Capase-3蛋白明顯上調(diào)(P<0.001)。上述結(jié)果提示在裸鼠腫瘤細胞中miRNA可通過抑制PTTG1蛋白的表達來拮抗PTTG1蛋白抑制細胞凋亡的作用,并激活活性Capase-3蛋白表達,從而促進了腫瘤細胞的凋亡。

15、 綜上所述,本課題的結(jié)論是在膠質(zhì)瘤組織中,PTTG1蛋白表達水平隨膠質(zhì)瘤惡性程度的增加相應增高,PTTG1在惡性膠質(zhì)瘤細胞系中高表達。PTTG1表達的升高與腫瘤分化和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。人腦膠質(zhì)瘤中PTTG1、MMP2、MMP9、Ki67的表達水平與膠質(zhì)瘤的病理分級成正相關(guān),提示在惡性膠質(zhì)瘤中PTTG1與膠質(zhì)瘤的惡性表型(增殖和侵襲)密切相關(guān)。microRNA干擾PTTG1表達后,western blot檢測的細胞增殖密切相關(guān)的核抗原Ki

16、67以及MAPK級聯(lián)反應中的靶標c-myc的表達下調(diào),MTT實驗的結(jié)果提示抑制PTTG1表達后U251、SHG-44人腦膠質(zhì)瘤細胞系的細胞增殖率均明顯下降,都出現(xiàn)了生長減慢。利用基因沉默技術(shù)靶向PTTG1的microRNA表達載體有效地抑制了膠質(zhì)瘤細胞系U251和SHG-44中PTTG1的表達,p53以及其下游調(diào)控基因p21WAF1/Cip1、Bax的表達都發(fā)生上調(diào)的變化,caspase-3的相對活性明顯升高,從而導致P53功能上調(diào)引起

17、Bax、P21表達上調(diào)從而激活caspase-3最終誘導膠質(zhì)瘤細胞發(fā)生凋亡。PTTG1的RNA干擾可以明顯逆轉(zhuǎn)U251人腦膠質(zhì)瘤細胞系的侵襲和遷移,MMP2、MMP9 Western雜交結(jié)果顯示表達顯著減少,提示PTTG1→bFGF→MMP→腫瘤細胞基底膜屏障突破這一調(diào)節(jié)通路可能是惡性腦膠質(zhì)瘤侵襲性產(chǎn)生的重要機制之一。轉(zhuǎn)染外源性microRNA抑制PTTG1基因的U251細胞在無免疫裸鼠皮下成瘤后,細胞生長減慢,膠質(zhì)瘤組織細胞出現(xiàn)增殖抑