bFGF siRNA表達(dá)質(zhì)粒對(duì)膠質(zhì)瘤中STAT3基因抑制作用的研究.pdf

1、目的:研究堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)小分子干擾RNA（siRNA）表達(dá)質(zhì)粒對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251中STAT3及cyclinD1和bcl-xl的抑制作用，探討膠質(zhì)瘤基因治療的新途徑。
　　 方法:用優(yōu)選靶序列siRNA850構(gòu)建siRNA表達(dá)質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo-shFGF2，然后采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)染入膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251細(xì)胞內(nèi)，用MTT法觀察不同質(zhì)粒用量即3ug、4ug和5ug，脂質(zhì)體用量10ul，對(duì)膠質(zhì)瘤

2、細(xì)胞系U251細(xì)胞的抑制作用，找出抑制效果最好的質(zhì)粒用量。用最佳質(zhì)粒用量分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)即24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)和96小時(shí)的MTT吸收值，觀察細(xì)胞增值活性。用免疫組化定性(測(cè)定轉(zhuǎn)染后24h)及westernblot（測(cè)定轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)）相對(duì)定量的方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后STAT3、cyclinD1和Bcl-xl蛋白表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果:1.MTT法顯示脂質(zhì)體用量10ul，bFGF siRNA質(zhì)粒

3、用量4ug對(duì)U251細(xì)胞的抑制作用最好。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，正常對(duì)照組、陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組的MTT吸收值無(wú)顯著性差異。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)和72小時(shí)，實(shí)驗(yàn)組與正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，均具有顯著性差異，表明對(duì)細(xì)胞增殖具有顯著的抑制作用;轉(zhuǎn)染后96小時(shí)，實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但與正常對(duì)照組相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2.免疫組化顯示:轉(zhuǎn)染后24小時(shí)實(shí)驗(yàn)組STAT3、CyclinD1和Bcl-xl在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251中表達(dá)

4、的陽(yáng)性率較正常對(duì)照組降低。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，正常對(duì)照組STAT3表達(dá)(+++)，陽(yáng)性細(xì)胞率為46.27％，實(shí)驗(yàn)組表達(dá)(+)，陽(yáng)性細(xì)胞率為14.23％，陰性對(duì)照組表達(dá)(++)，陽(yáng)性細(xì)胞率為28.39％;正常對(duì)照組Bcl-Xl表達(dá)(+++)，陽(yáng)性細(xì)胞率為51.3％，實(shí)驗(yàn)組表達(dá)(+)，陽(yáng)性細(xì)胞率為10.56％，陰性對(duì)照組表達(dá)(++)，陽(yáng)性細(xì)胞率為27.82％;正常對(duì)照組CyclinD1表達(dá)(+++)，陽(yáng)性細(xì)胞率為48.79％，實(shí)驗(yàn)組表達(dá)(+)，

5、陽(yáng)性細(xì)胞率為8.89％，陰性對(duì)照組表達(dá)(++)，陽(yáng)性細(xì)胞率為31.36％。
　　 3.western blot結(jié)果:用FlourchmeFC2軟件分析western凝膠圖像可以說明轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h均顯示STAT3、CyclinD1和Bcl-xl的實(shí)驗(yàn)組蛋白條帶的AVG值較正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組降低，且質(zhì)粒的抑制作用48小時(shí)最強(qiáng)，其次是72小時(shí)，最后是24小時(shí)。
　　 結(jié)論:用優(yōu)選靶序列siRNA850構(gòu)建的s