蝎氯毒素BmKCT的碘標(biāo)記及對(duì)腦膠質(zhì)瘤抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：①蝎氯毒素BmKCT碘標(biāo)記方法的建立。②131I-BmKCT對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期影響的體外實(shí)驗(yàn)。③觀察131I-BmKCT在腦膠質(zhì)瘤裸鼠模型體內(nèi)不同時(shí)間的組織分布，探索131I-BmKCT作為腦膠質(zhì)瘤放射性核素顯像劑的潛力。 方法： 前期基礎(chǔ)性研究：合成BmKCT設(shè)計(jì)引物并構(gòu)建質(zhì)粒，通過(guò)pGEX系統(tǒng)表達(dá)BmKCT，通過(guò)GST親和層析和凝膠過(guò)濾可獲得純化的BmKCT。 第一階段：131I間接標(biāo)記BmK

2、CT和對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體外抑制作用 通過(guò)?；瘎?-(4-羥苯基)丙酸-N琥珀酰胺酯（Bolton-Hunter試劑）將131I標(biāo)記在羥苯基的2，5位置上，再將琥珀酰胺酯水解，通過(guò)一個(gè)酰氨鍵將3-(4-羥基-5-131I-苯基)接在蛋白或多肽的末端氨基上。 MTT法測(cè)定腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（GIR），取C6細(xì)胞接種96孔板，5.0×103個(gè)/孔，設(shè)多個(gè)平行孔，貼壁后分別加入含不同放射活度131I-BmKCT的培養(yǎng)液，未經(jīng)標(biāo)記的

3、BmKCT的培養(yǎng)液，空白組加入等體積不完全培養(yǎng)液（不含血清），MTT法測(cè)定吸光度值，計(jì)算GIR。根據(jù)計(jì)算結(jié)果繪制細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率曲線。 流式細(xì)胞儀分析測(cè)定C6細(xì)胞DNA含量與周期分布，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶，細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組加入含不同放射活度131I-BmKCT的培養(yǎng)液，未經(jīng)標(biāo)記的BmKCT的培養(yǎng)液，空白組加入等體積不完全培養(yǎng)液（不含血清），培養(yǎng)處理后流式細(xì)胞儀進(jìn)行DNA含量和細(xì)胞周期分析。 第二階

4、段：131I-BmKCT在裸鼠體內(nèi)的組織分布及SPECT顯像 將C6細(xì)胞懸液接種于健康裸鼠背部，分別在3h、24h、48h進(jìn)行SPECT顯像。 結(jié)果： 前期基礎(chǔ)性研究：融合蛋白質(zhì)經(jīng)質(zhì)譜鑒定，分子量與GST融合蛋白理論上一致（31197），ⅹ因子酶切融合蛋白質(zhì)后，再次質(zhì)譜分析，分子量（3748）與BmKCT（3749）相一致。 第一階段：間接標(biāo)記法獲得的131I-BmKCT放射化學(xué)純度達(dá)94％，總產(chǎn)率達(dá)35

5、％。細(xì)胞結(jié)合試驗(yàn)顯示細(xì)胞結(jié)合率倒數(shù)與細(xì)胞倒數(shù)線形相關(guān)，相關(guān)系數(shù)R=0.75。 0.2mg/ml濃度的BmKCT對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制率為90.5％，與空白組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），BmKCT的濃度為2μg/ml時(shí)，抑制率為60.5％，當(dāng)131I-BmKCT放射性濃度為50μCi/ml（濃度小于2μg/ml），抑制率為71.2％，131I-BmKCT抑制細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)的能力優(yōu)于未標(biāo)記的BmKCT。BmKCT主要將細(xì)胞