神經(jīng)系統(tǒng)特異表達(dá)基因Human Neurotrimin對膠質(zhì)瘤抑制作用的研究.pdf

1、在本實(shí)驗(yàn)室前期工作中，從人胎腦cDNA文庫中篩選到一個新cDNA克隆，因與大鼠Neurotrimin基因同源性很高，因此命名為Human Neurotrimin(HNT)。HNT在腦中高表達(dá)，屬于免疫球蛋白超家族成員，具有三個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，屬于沒有跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)的GPI錨蛋白。目前發(fā)現(xiàn)HNT的主要功能為細(xì)胞黏附和促進(jìn)神經(jīng)突觸生長。我們在點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)HNT在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中存在表達(dá)下調(diào)的趨勢，于是推測該基因可能與膠質(zhì)瘤形成有關(guān)。

2、 我們應(yīng)用Realtime PCR的方法檢測了20例膠質(zhì)瘤病理樣本和6株膠質(zhì)瘤細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)HNT在70％(14/20)膠質(zhì)瘤組織和全部六種細(xì)胞系中明顯表達(dá)下調(diào)?？紤]低表達(dá)可能由表觀遺傳學(xué)修飾引起，分別用甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑(5-aza-2-deoxycytidine)和去乙酰酶抑制劑(TSA)處理膠質(zhì)瘤細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑處理后HNT表達(dá)上調(diào)，推測HNT在膠質(zhì)瘤中低表達(dá)可能由于啟動子區(qū)CpG島甲基化。我們用Bisulfite S

3、equcing實(shí)驗(yàn)證明HNT啟動子區(qū)CpG島在胎腦中處于非甲基化狀態(tài)，而在T98G細(xì)胞中存在部分甲基化現(xiàn)象。為了證明甲基化引起基因表達(dá)下調(diào)，我們又應(yīng)用熒光素酶報(bào)告基因(Imciferase Assay)方法尋找HNT的核心啟動子區(qū)，確認(rèn)-606～-136bp可能是基因的核心啟動子區(qū)。該區(qū)域剛好是發(fā)生甲基化的CpG島所在區(qū)域，并存在Spl結(jié)合位點(diǎn)，于是我們希望探索Spl對于HNT轉(zhuǎn)錄激活的作用，進(jìn)一步研究HNT的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。 在

4、上述工作基礎(chǔ)上，我們在細(xì)胞整體水平上研究HNT對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響。我們將空病毒(Ad)和表達(dá)HNT的腺病毒(Ad-HNT)分別感染U251細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)感染Ad-HNT后，細(xì)胞周期被阻滯在G1期。進(jìn)而研究HNT可能影響的CDK和CDKI因子，半定量PCR發(fā)現(xiàn)p21，p16和p19可以被HNT其激活，接著應(yīng)用westernblot檢測蛋白水平的變化，發(fā)現(xiàn)p21，p27被明顯上調(diào)。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)HNT可以抑制活性狀態(tài)HNT并抑制cyclin