神經(jīng)系統(tǒng)特異表達(dá)的新基因NDNF功能及發(fā)育學(xué)研究.pdf

1、正在發(fā)育和成熟的神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元的命運(yùn)一部分是被神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的成員所掌控的。該家族成員包括神經(jīng)生長因子(NGF)、腦源性神經(jīng)生長因子(BDNF)、營養(yǎng)因子-3(NT-3)及營養(yǎng)因子4/5(NT-4/5)。從細(xì)胞中分泌的神經(jīng)營養(yǎng)因子到達(dá)靶區(qū)域后，可以保護(hù)神經(jīng)元、避免凋亡，僅有那些獲得充足營養(yǎng)因子的神經(jīng)元才能生存。NGF可以促進(jìn)神經(jīng)元前體細(xì)胞的增殖和分化；BDNF除了可以促進(jìn)神經(jīng)元的生存和修復(fù)損傷功能之外，還在突觸的功能可塑性、神經(jīng)遞質(zhì)

2、與神經(jīng)肽的產(chǎn)生和興奮性方面發(fā)揮了重大作用；GDNF可提高多巴胺神經(jīng)元和運(yùn)動神經(jīng)元的生存率；NT-3可以促進(jìn)CNS和PNS中不同類型的神經(jīng)元的生長、分化、包括神經(jīng)巢細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的前體。大量的研究均表明，神經(jīng)營養(yǎng)因子對神經(jīng)元的生存、分化以及突觸可塑性方面有著重要的作用，它們已經(jīng)成為運(yùn)動神經(jīng)元退行性病變、肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)、脊髓性肌萎縮、小兒麻痹癥后期綜合癥臨床治療的候選藥物；而且也是治療癲癇發(fā)作，阿爾茨海默病，帕金森病等神經(jīng)退行

3、性疾病的潛在藥物。
　　 實驗?zāi)康模?br>　　 本研究從神經(jīng)系統(tǒng)特異表達(dá)的新基因NDNF入手，對其生物學(xué)功能進(jìn)行初步研究，并確定了其表達(dá)的空間定位及與發(fā)育的關(guān)系，希望能夠更好地理解神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程與機(jī)制，也希望能為中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病提供一定的臨床治療依據(jù)。
　　 實驗方法：
　　 本課題分別使用分子生物學(xué)技術(shù)和形態(tài)學(xué)方法來研究NDNF的功能和時空發(fā)育的變化。通過序列比對和保守性分析，確定目的基因，使用P

4、CR技術(shù)克隆目的基因，并構(gòu)建真核表達(dá)系統(tǒng)。轉(zhuǎn)染入真核細(xì)胞中獲取含重組蛋白的培養(yǎng)基，作用于原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞，觀察神經(jīng)元形態(tài)的變化。transwell遷移實驗，研究NDNF對神經(jīng)元的遷移的影響。免疫印跡實驗用來證實該基因在各組織中的表達(dá)情況。使用人工合成的肽段制備抗體，進(jìn)行免疫熒光和免疫組化研究，分別觀察E16-P90齡老鼠腦內(nèi)NDNF的時間和空間的分布特點。
　　 實驗結(jié)果：
　　 1.基因克隆與載體構(gòu)建基因克隆測

5、序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫相符。真核載體構(gòu)建成功，轉(zhuǎn)染入真核細(xì)胞后，定位在高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)區(qū)，具有糖基化修飾，這些均符合預(yù)測的分泌蛋白特征。培養(yǎng)基使用Westernblot證實NDNF確實可以分泌。
　　 2.對神經(jīng)元的營養(yǎng)功能含重組蛋白的培養(yǎng)基作用于原代培養(yǎng)的海馬錐體神經(jīng)元，與對照組相比，神經(jīng)元的突起明顯長于對照組，胞體直徑明顯大于對照組。Transwell實驗進(jìn)一步證實了NDNF不僅對神經(jīng)元有營養(yǎng)作用，而且還可促進(jìn)神經(jīng)元的遷移。通過與B

6、DNF對神經(jīng)元的遷移作用相比，可以發(fā)現(xiàn)NDNF對神經(jīng)元具有很強(qiáng)的營養(yǎng)作用。
　　 3.NDNF的組織分布和發(fā)育學(xué)特點分別從小鼠大腦、脊髓、肝臟、心臟和腎臟中提取蛋白，Westernblot實驗證實了NDNF僅在大腦和脊髓中存在，免疫熒光實驗進(jìn)一步證實了該結(jié)論，而且在神經(jīng)系統(tǒng)的定位與神經(jīng)元符合，而不是星型膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)。大腦皮層Cajal-Retzius細(xì)胞、小腦浦肯野細(xì)胞表達(dá)水平較高。NDNF從胚胎期到成年小鼠一直表達(dá)，且與神經(jīng)元