tap基因在果蠅神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的功能與調(diào)控機制研究.pdf

1、目的：果蠅tap基因編碼進化保守的堿性螺旋-環(huán)-螺旋（bHLH）蛋白，本研究初步探索其在果蠅神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中的功能和調(diào)控機制。
　　方法：基于NCBI數(shù)據(jù)庫中果蠅Tap蛋白的氨基酸序列，采用生物信息學技術(shù)從Tap蛋白的理化特征、跨膜區(qū)域、信號肽、結(jié)構(gòu)域、三維結(jié)構(gòu)和物種間同源蛋白進化關(guān)系等方面對Tap蛋白的結(jié)構(gòu)和功能進行分析。構(gòu)建pUAS-tap重組質(zhì)粒，運用顯微注射技術(shù)和mini-white基因篩選，獲得UAS-tap轉(zhuǎn)基因果蠅

2、，并將轉(zhuǎn)基因品系分別和ap-GAL4品系、GMR-GAL4品系雜交，采用定量RT-PCR方法檢測雜交前后tap基因表達水平，并在顯微鏡下觀察雜交后代的發(fā)育情況。按照Trizol法提取野生型果蠅、tap基因突變體果蠅胚胎期總RNA，采用瓊脂糖凝膠電泳、NanoDrop、生物分析儀2100系統(tǒng)檢測總RNA的質(zhì)量。制備好的RNA測序文庫，采用HiSeq2500平臺、單端SE50策略進行高通量測序。測序所得的原始數(shù)據(jù)經(jīng)去接頭、去低質(zhì)量序列處理后

3、得到高質(zhì)量干凈序列進行后續(xù)生物信息學分析，包括參考基因組比對分析、基因表達水平定量、差異表達基因DEGs分析、GO/KEGG富集分析，利用實時定量PCR方法驗證部分DEGs。
　　結(jié)果：生物信息學的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)Tap蛋白屬于不穩(wěn)定的親水蛋白，沒有跨膜區(qū)及信號肽，位于細胞核發(fā)揮作用，具有一個堿性螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域。Tap蛋白與來源于NeuroD1的模板2ql2.1.B有61.02％的氨基酸序列一致，Tap蛋白與人類和嚙齒動物的同源

4、蛋白高度同源，在系統(tǒng)發(fā)育樹中距離最近。成功構(gòu)建了pUAS-tap重組質(zhì)粒，通過顯微注射與轉(zhuǎn)基因果蠅篩選、平衡及定位，共獲得5個獨立的轉(zhuǎn)基因品系。tap基因靶向表達后引起成蟲出現(xiàn)糙眼，翅膀出現(xiàn)異位剛毛和異位翅脈表型。RNA-Seq結(jié)果發(fā)現(xiàn)，野生型和tap基因突變體果蠅樣品之間共有6064個DEGs，其中上調(diào)基因2720個，下調(diào)基因3344個。GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)DEGs主要參與細胞過程、有機物代謝過程、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運、蛋白質(zhì)定位等生物學過程，

5、發(fā)揮的分子功能集中在蛋白質(zhì)結(jié)合和核苷酸結(jié)合。KEGG代謝通路富集分析發(fā)現(xiàn)DEGs顯著富集的Pathway有剪接體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工、Notch信號通路、背腹軸形成等。實時定量PCR驗證結(jié)果發(fā)現(xiàn)20個隨機選擇基因的表達趨勢與RNA-Seq結(jié)果一致。
　　結(jié)論：果蠅 Tap蛋白具有 bHLH蛋白家族的典型結(jié)構(gòu)，tap基因通過 Notch信號通路介導的原神經(jīng)模式，或者調(diào)節(jié)神經(jīng)前體細胞分化而參與胚胎早期神經(jīng)發(fā)育過程。RNA-Seq分析結(jié)果