全反式維甲酸誘導(dǎo)大鼠腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常的實驗研究.pdf

1、目的：利用全反式維甲酸（all-trans retinoic acid, ATRA）制作大鼠腸神經(jīng)系統(tǒng)（Enteric nervous system）發(fā)育異常的動物模型，應(yīng)用蛋白基因產(chǎn)物9.5（protein gene product9.5, PGP9.5）及突觸素(synaptophysin, SYP)動態(tài)觀察 ENS在胚胎發(fā)育過程的陽性表達(dá)及變化并進行透射電鏡超微結(jié)構(gòu)研究，以期了解ENS發(fā)育及ATRA是否誘導(dǎo)ENS異常發(fā)育，為臨床防

2、治ENS發(fā)育異常誘發(fā)的疾病提供實驗基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.實驗一
　　40只健康成熟未孕的SD雌鼠，體重250～300g，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。雌雄大鼠按1：1比例于午夜合籠，上午8:10-9:10時檢測有陰道栓排出的雌鼠，即認(rèn)為已交配，此日標(biāo)為妊娠第0天（Embryonic day0，E0），正常飼養(yǎng)。將已孕雌鼠30只隨機分為2組，每組15只。實驗組于E10將ATRA按100 mg/kg一次性灌胃；對照

3、組于E10給予體積(2.5 mL/kg)橄欖油，繼續(xù)飼養(yǎng)。兩組分別于E14-20腹腔麻醉下行剖宮術(shù)。檢查判定所有胚胎存活數(shù)量及畸形并記錄。制作結(jié)直腸段標(biāo)本，行 HE常規(guī)染色及PGP9.5和SYP免疫組化。已知陽性切片作陽性對照，磷酸鹽緩沖液代替一抗作空白對照。圖像分析、采圖、數(shù)據(jù)記錄分析。
　　2.實驗二
　　已孕母鼠8只隨機分為2組，每組4只。實驗組于E10將ATRA按100 mg/kg灌胃；對照組于E10給予體積(2.5

4、 mL/kg)橄欖油，繼續(xù)飼養(yǎng)。兩組于E21腹腔麻醉下行剖宮術(shù)。制作結(jié)直腸電鏡標(biāo)本，預(yù)切片定位，超薄切片，透射電鏡觀察，拍片記錄分析。
　　結(jié)果：
　　1、免疫組織化學(xué)：
　?。?）對照組: E16，在直腸腸壁內(nèi)可見散在稀疏分布的棕色 PGP9.5陽性細(xì)胞，直腸上端結(jié)腸壁內(nèi)未能見SYP陽性細(xì)胞。從E16-18，PGP9.5環(huán)肌漿膜側(cè)出現(xiàn)陽性細(xì)胞，成散在單個出現(xiàn)，粘膜下陽性細(xì)胞少見。直腸壁內(nèi)可見SYP棕黃色成條索狀的陽性

5、表達(dá)，主要分布在腸壁漿膜下層。E20， PGP9.5陽性細(xì)胞呈黃褐色團簇狀，環(huán)肌層和縱肌層結(jié)構(gòu)清晰，排列整齊，粘膜下可見陽性細(xì)胞。SYP在E20陽性表達(dá)增強。
　?。?）實驗組: E16直腸肌間組織開始分化，結(jié)構(gòu)整齊，PGP9.5在直腸中可顯示散在分布的陽性細(xì)胞，與正常相比無明顯改變，直腸大部分未見SYP陽性細(xì)胞。E18開始，近端直腸可見PGP9.5陽性表達(dá)，直腸壁內(nèi)可見棕黃色成條索狀的SYP陽性表達(dá)，但是與正常相比，發(fā)育滯后，體

6、積較小，分布稀疏。E18-E20陽性細(xì)胞較正常組密度減低。
　　2、透射電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察：
　?。?）對照組：神經(jīng)叢主要分布在環(huán)形肌和縱行肌之間，肌間結(jié)構(gòu)排列整齊，細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)可見微管、微絲、線粒體和密集的核糖體，有無髓神經(jīng)纖維分布，軸突終末都有突觸聯(lián)系。
　　（2）實驗組：肌層肌間結(jié)構(gòu)紊亂，可見軸突變性或偶見不典型突觸結(jié)構(gòu)，未見典型無髓神經(jīng)纖維，微管、微絲顯示不清，各種細(xì)胞器結(jié)構(gòu)模糊，線粒體腫脹。不成熟神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分布