NeurexinⅡ基因在大鼠及不同胎齡大鼠胚胎腸神經(jīng)系統(tǒng)的表達及意義.pdf

1、目的:腸神經(jīng)系統(tǒng)(Enteric nervous system，ENS)是由分布于消化道管壁內(nèi)的神經(jīng)元及神經(jīng)纖維組成的內(nèi)在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，接受中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervoussystem，CNS)的調(diào)節(jié)，但相對獨立的調(diào)節(jié)胃腸道的運動、消化等各項功能。ENS由神經(jīng)嵴細胞發(fā)育形成，多種基因在其發(fā)育形成過程中發(fā)揮重要作用，如RET基因、SOX10基因、GDNE基因等。腸神經(jīng)元發(fā)育異常性疾病(Neuronal intestinalmalf

2、ormations，NIM)是一類常見且嚴重危害患兒健康水平的消化道畸形，以消化管壁神經(jīng)分布及功能異常為主要特征，是多種因素影響ENS發(fā)育，最終導致ENS神經(jīng)細胞在數(shù)量、質(zhì)量、分布及功能上異常的不同結(jié)局，其病因尚未完全闡明。NIM主要包括先天性巨結(jié)腸(Hirschsprung's disease，HD)、腸神經(jīng)節(jié)細胞發(fā)育不良(Intestinal neuronal dysplasia,IND)、神經(jīng)節(jié)細胞減少癥(Hypoganglion

3、osis，HG)、神經(jīng)節(jié)細胞未成熟(Immaturity of ganglion cells，IGC)、混合畸形及未分類的腸神經(jīng)發(fā)育不良。研究證實Neurexins在CNS中廣泛表達，且在功能性突觸的發(fā)生、分化、成熟及維持功能發(fā)面均發(fā)揮重要作用;我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)，Neurexins亦在ENS中廣泛表達，與胃腸動力紊亂性疾病如HD有密切關(guān)系，Neurexins、其配體Neuroligins及相關(guān)的神經(jīng)介質(zhì)谷氨酸與γ-GABA異常是受累

4、腸管蠕動功能障礙的重要原因。據(jù)此，實驗通過不同實驗方法對胎齡16天、18天、20天的大鼠胚胎及出生24小時內(nèi)的乳鼠（E16組、E18組、E20組、Ep0組）及部分成年大鼠結(jié)腸ENS中NeurexinⅡ基因的表達進行檢測，探討NeurexinⅡ基因與ENS發(fā)育的相關(guān)關(guān)系及NeurexinⅡ基因與NIM的可能關(guān)系。
　　方法:對清潔級健康的Wistar雌性與雄性大鼠進行隨機配組，單獨交配使雌鼠受孕，受孕后在相同條件下單獨飼養(yǎng)至相應(yīng)孕齡

5、，麻醉并處死孕齡16、18和20天孕鼠、出生24小時內(nèi)乳鼠，解剖獲取胚胎第16、18、20天和出生24小時內(nèi)及部分成年大鼠臨近回盲部、長度1.0cm左右的結(jié)腸全層組織標本。對成年大鼠結(jié)腸標本進行免疫組織化學DAB染色，觀察NeurexinⅡα蛋白在ENS中的表達及表達部位;運用免疫組織化學DAB染色、Western blot及實時熒光定量PCR檢測胎齡16、18、20天大鼠胚胎和出生24小時內(nèi)乳鼠結(jié)腸標本中NeurexinⅡα蛋白及Ne

6、urexinⅡmRNA的表達。
　　結(jié)果:免疫組織化學DAB染色結(jié)果顯示NeurexinⅡα蛋白陽性染色成棕黃色或黃褐色，主要表達于ENS肌間神經(jīng)叢神經(jīng)節(jié)細胞，在黏膜下層及黏膜層亦有少量表達;其達量隨胚胎發(fā)育自胚胎第16天至出生后第一天逐漸增加。Westernblot實驗顯示NeurexinⅡα蛋白在E16、E18、E20和Ep0各組結(jié)腸全層組織提取總蛋白中的相對含量分別為0.054±0.009、0.106±0.020、0.215

7、±0.013、0.280±0.030，隨胚胎發(fā)育NeurexinⅡα蛋白表達逐漸增加，組間比較與兩兩比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，與免疫組化DAB染色結(jié)果所示趨勢一致。實時熒光定量PCR實驗結(jié)果顯示在E16、E18、E20和Ep0各組結(jié)腸標本中NeurexinⅡmRNA相對表達依次為0.390±0.029、0.552±0.054、0.748±0.065、1.000±0.000，與其在蛋白水平的表達趨勢一致，組間比較與兩兩比較