ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的抑制增強(qiáng)伊馬替尼對(duì)大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞抑制作用的研究.pdf_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、研究背景:
   Glioblastoma(GBM)是成年人最常見的腦部腫瘤[1],美國(guó)每年將近有16,800新診斷的腦部腫瘤,其中60%是GBM[2][3];最近的研究表明:患者1年生存率17.7%,2年生存率約為3.3%[4],3年以上的生存率約為1.8%~2.2%[5][6],平均中位生存率大概是8~12個(gè)月,盡管如此,在過去的20年里,在GBM治療方法上基本沒有進(jìn)展[7][8],目前認(rèn)為,在較徹底的外科手術(shù)切除病灶后,結(jié)

2、合放射治療比單獨(dú)只接受外科手術(shù)的療效好,也是目前GBM治療的主要手段[9][10],而只進(jìn)行放射治療不接受外科手術(shù),治療效果也較差,容易原位復(fù)發(fā)[11][12],同時(shí)由于GBM的多型性使預(yù)后十分不樂觀;因而尋找GBM有效的治療手段,是目前醫(yī)學(xué)界的一個(gè)難題,而伊馬替尼(Imatinib,STI571,Glivec,Gleevee)的出現(xiàn)為GBM的治療帶來了一線曙光。
   Imatinib是一個(gè)小分子的靶向酪氨酸激酶抑制劑,它有三

3、個(gè)主要的作用靶點(diǎn),其中PDGFR的酪氨酸激酶是其作用靶點(diǎn)之一[13]。PDGF和PDGFR在膠質(zhì)瘤是過度表達(dá)的,并且在膠質(zhì)瘤的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中扮演了重要的角色[14];臨床前研究表明,Imatinib通過抑制僅在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中才被高度激活PDGF/PDGFR自分泌環(huán),使Rad51的表達(dá)降低,增加了膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)放射的敏感性,從而可達(dá)到增強(qiáng)治療GBM療效的目的[15][16],綜上所述,這些證據(jù)都預(yù)示著Imatinib可能是治療GBM的很有希望

4、的一個(gè)藥物,然而臨床試驗(yàn)結(jié)果卻是令人失望的,Imatinib治療膠質(zhì)瘤的效果微乎其微[17][18]。人們推測(cè)因?yàn)橹缓芸赡苁怯捎贏BC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的存在,使到達(dá)靶細(xì)胞的濃度太低了,無法達(dá)到治療效果。膠質(zhì)瘤細(xì)胞上ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)的多藥耐藥基因的表達(dá)如何?Imatinib是否誘導(dǎo)相關(guān)基因和相關(guān)蛋白的表達(dá)?哪種ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在膠質(zhì)瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)Imatinib的過程中起了主要的作用?如何能增強(qiáng)Imatinib對(duì)膠質(zhì)瘤的療效?本文圍繞上述問題展開研

5、究。
   研究目的:
   1.研究Imatinib對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡、細(xì)胞周期的影響;
   2.研究Imatinib對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞膜上ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因和相關(guān)蛋白的表達(dá)的影響;
   3.觀察Imatinib與主要的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之一的P-糖蛋白抑制劑valspodar聯(lián)合給藥后,Imatinib對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖抑制作用的影響以及細(xì)胞內(nèi)Imatinib含量的變化,來研究P-糖蛋

6、白在C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)Imatinib過程中的作用。
   4.觀察P-糖蛋白表達(dá)水平降低后,Imatinib對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖抑制作用的影響,進(jìn)一步研究P-糖蛋白在C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)Imatinib過程中的作用。
   研究方法
   1.Imatinib對(duì)大鼠C6細(xì)胞的增殖抑制作用
   (1)研究大鼠C6細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線
   常規(guī)培養(yǎng)C6細(xì)胞,傳代,分別于24、48、72、96、120、

7、144和168小時(shí),臺(tái)盼蘭拒染活細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)情況,繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線;
   (2)研究Imatinib處理前后C6細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化常規(guī)培養(yǎng)C6細(xì)胞,置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形狀、大小、生長(zhǎng)狀態(tài)等;
   (3)研究Imatinib對(duì)C6細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用常規(guī)培養(yǎng)C6細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)時(shí)將細(xì)胞分為9個(gè)濃度組,分別為對(duì)照組、0.039μM、0.078μM、0.156μM、5μM、10μM、15μM、17.5μM和20μM

8、組,分別于作用24h、48h、72h和96h用MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率;
   (4)研究Imatinib處理C6細(xì)胞不同時(shí)間的IC50
   常規(guī)培養(yǎng)C6細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)時(shí)將細(xì)胞分為4個(gè)時(shí)間組,分別為24h、48h、72h和96h,每個(gè)時(shí)間組下設(shè)9個(gè)濃度組,分別為對(duì)照組、0.039μM、0.078μM、0.156μM、5μM、10μM、15μM、17.5μM和20μM組,測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)下的IC50;
   (5)研究

9、Imatinib對(duì)C6細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用和對(duì)細(xì)胞周期的影響
   常規(guī)培養(yǎng)C6細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)時(shí)將細(xì)胞分為4組,分別為對(duì)照組、0.156μM組、10μM組和15μM組,對(duì)照組不加藥物。Hoechst 33342/PI染色、Annexin V-FITC/PI雙染法、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞周期分布情況。
   2.C6細(xì)胞ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因的表達(dá)及改變
   常規(guī)培養(yǎng)大鼠C6細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)時(shí)將細(xì)胞按Imminib處

10、理濃度分為4組,分別為對(duì)照組、低濃度(0.156μM)組、中濃度(10μM)組和高濃度(15μM)組,各濃度組下設(shè)3個(gè)時(shí)間點(diǎn),分別為24h、48h和72h;用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法分別檢測(cè)C6細(xì)胞上mdrla、mdrlb、mrp1、mrp4和bcrp等基因的表達(dá)情況,以及Imatinib處理C6細(xì)胞后,上述基因表達(dá)的變化情況。
   3.Imatinib與P-gp抑制劑valspodar聯(lián)合給藥后,對(duì)C6細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用

11、   常規(guī)培養(yǎng)大鼠C6細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)時(shí)將細(xì)胞分為對(duì)照組、Imatinib組、valspodar組和Imatinib+valspodar組;其中對(duì)照組不加任何藥物,Imatinib+valspodar組在加入valspodar30min后加入Imatinib。加藥后作用72h,MTT法檢測(cè)各組的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。
   4.Imatinib與P-gp抑制劑valspodar聯(lián)合給藥前后,C6細(xì)胞內(nèi)Imatinib含量的變化
  

12、 常規(guī)培養(yǎng)大鼠C6細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)時(shí)將細(xì)胞分為2組,分別為Imatinib組和Imatinib+valspodax組;其中Imainib組Imatinib的濃度為1μM,Imatinib+valspodar組中Imatinib的終濃度為1μM,valspodar的終濃度為0.5μM;每組的細(xì)胞各培養(yǎng)3瓶,用LC-MS-MS法測(cè)定Imatinib聯(lián)合valspodar前后,細(xì)胞內(nèi)Imatinib的含量。
   5.Mdrlb基因干擾后

13、,Imatinib對(duì)C6細(xì)胞的增殖抑制作用
   常規(guī)培養(yǎng)大鼠C6細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)時(shí)將細(xì)胞按Imatinib濃度分為8組,分別為對(duì)照組、0.156μM、10μM、15μM、干擾對(duì)照組、干擾后0.156μM、干擾后10μM和干擾后15μM組,其中對(duì)照組不加任何藥物,干擾對(duì)照組只加lipo2000脂質(zhì)體和非特異性siRNA。RT-qpcr和western blot分別檢測(cè)RNA干擾后,mdr1b基因和P-糖蛋白的表達(dá)水平;MTT法檢測(cè)各組

14、細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率。
   6.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
   實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。若只有一種影響因素則采用單因素方差分析(one-way ANOVA);兩種因素以上采用析因分析,有交互效應(yīng)時(shí)進(jìn)行單因素效應(yīng)分析,無交互效應(yīng)時(shí),每種因素可采用單因素方差分析;多重比較若方差齊采用LSD法,方差不齊時(shí)采用近似F檢驗(yàn)(Welch方法)及多重比較的Dunnett's T3方法;兩組間均

15、數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析;P<0.05(雙側(cè))表示差異有顯著性。
   結(jié)論:
   1.本實(shí)驗(yàn)首次報(bào)道Imatinib可抑制C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),且具有時(shí)間-濃度依賴性但I(xiàn)C50較高;
   2.Imatinib抑制C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)的機(jī)制是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生,細(xì)胞凋亡率呈時(shí)間-濃度依賴性;同時(shí)Imatinib可使C6細(xì)胞在G0/G1期出現(xiàn)阻滯。
   3.本實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)Imatinib可誘導(dǎo)AB

16、C轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因和相關(guān)蛋白的表達(dá),介導(dǎo)了Imatinib對(duì)C6細(xì)胞的增殖抑制作用;
   4.P-gp抑制劑Valspodar與Imatinib聯(lián)合給藥后,明顯增強(qiáng)Imatinib對(duì)C6細(xì)胞的增殖抑制作用,表明P-gp可介導(dǎo)C6細(xì)胞對(duì)Imatinib的不敏感性;
   5.RNA干擾使P-gp蛋白表達(dá)水平下調(diào)后,明顯增強(qiáng)Imatinib對(duì)C6細(xì)胞的增殖抑制作用,進(jìn)一步表明P-gp可介導(dǎo)C6細(xì)胞對(duì)Imatinib的不敏感

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