2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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1、蛋白激酶在多種疾病,特別是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用,以其為藥物靶點(diǎn)的酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors,TKIs)則成為近年藥物研發(fā)的熱點(diǎn)。已上市藥物已經(jīng)在多種腫瘤的治療中顯示出其較傳統(tǒng)治療藥物的優(yōu)越性,部分已成為治療腫瘤的一線用藥。但是隨著這些藥物的應(yīng)用,其不良反應(yīng)也逐漸暴露出來,其中較為嚴(yán)重的是心臟毒性。TKIs引起的心臟毒性主要表現(xiàn)為慢性充血性心力衰竭,一經(jīng)發(fā)生,對(duì)患者健康將造成嚴(yán)重影響。因

2、此,研究TKIs導(dǎo)致的心臟毒性機(jī)制及其有效對(duì)抗藥物顯得尤為重要。
  臨床已經(jīng)報(bào)道具有心臟毒性的TKIs藥物有伊馬替尼,蘇尼替尼,尼羅替尼,達(dá)沙替尼等,實(shí)驗(yàn)研究顯示,在離體培養(yǎng)心肌細(xì)胞和整體動(dòng)物模型上,伊馬替尼(Imatinib,IM)和蘇尼替尼(sunitinib,SU)均可導(dǎo)致明顯線粒體功能異常,目前引起上述線粒體損傷的細(xì)胞內(nèi)分子機(jī)制尚不清楚,有實(shí)驗(yàn)表明伊馬替尼會(huì)誘導(dǎo)離體培養(yǎng)的新生大鼠心室肌細(xì)胞(NRVMs)中PKCδ表達(dá)水平

3、明顯增加[12]。已知蛋白激酶C(proteinkinase C,PKC)是一類絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶,在跨膜信號(hào)傳遞過程中起重要作用,能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝、生長(zhǎng)、增殖和分化等。迄今,已鑒定出至少10種PKC亞型(異構(gòu)體),依據(jù)它們的結(jié)構(gòu)與激活機(jī)制分為三類:傳統(tǒng)型PKC(cPKC,包括α、βⅠ、βⅡ和γ),新型PKC(nPKC,包括δ、ε、π和θ),非典型PKC(aPKC,包括ζ、ι/λ)。在近幾年的研究中,發(fā)現(xiàn)PKC各亞型的過度激活參與

4、了各種心臟疾病[20,31]。有研究表明,激活PKCδ會(huì)導(dǎo)致線粒體丙酮酸脫氫酶激酶激活,這抑制了丙酮酸脫氫酶和ATP再生并且還會(huì)觸發(fā)細(xì)胞壞死[12,13,10];因此,我們假定,PKC過度激活可能是此類藥物產(chǎn)生心肌細(xì)胞毒性的重要途徑。為驗(yàn)證我們的假設(shè),本實(shí)驗(yàn)利用離體培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞(NRVMs),研究PKC抑制劑或抑制肽(主要研究心肌中富含的cPKCs和nPKCs中的PKCδ、ε亞型)對(duì)TKIs藥物伊馬替尼(Imatinib,IM

5、)和蘇尼替尼(Sunitinib,SU)導(dǎo)致的心肌細(xì)胞毒性作用的影響。研究對(duì)闡明TKIs類藥物心臟毒性機(jī)制、防治心臟毒性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
  目的:研究cPKCs和PKCδ、ε亞型抑制劑或抑制肽對(duì)IM和SU導(dǎo)致的心肌細(xì)胞毒性作用的影響。
  方法:新生1-2天SD大鼠,分離心室肌細(xì)胞,用DMEM/F-12培養(yǎng)基培養(yǎng)三天,首先分別孵育不同濃度的IM(2、5、10μM)和SU(1、5、10μM),在48h用ATP檢測(cè)試劑盒和FLU

6、Ostar Omega全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ATP的含量,72h用LDH檢測(cè)試劑盒和FLUOstar Omega全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞外LDH釋放量,線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒和激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)線粒體膜電位(MMP)的改變。然后,觀察非選擇性、選擇性PKC抑制劑或抑制肽對(duì)IM和SU細(xì)胞毒性的影響。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用OriginPro8.6進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,n代表實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)。兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn),P<0.05

7、時(shí)認(rèn)為兩組間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
  結(jié)果:
  (1)IM和SU對(duì)NRVMs的毒性作用不同濃度IM(2、5、10μM)和SU(1、5、10μM)與NRVMs孵育48h細(xì)胞內(nèi)ATP含量呈濃度依賴性減少,72h檢測(cè)的LDH釋放量亦隨著濃度的增加而明顯增多。
  分別孵育10μM的IM和SU,于24、48及72h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ATP的含量,LDH釋放量以及MMP變化。結(jié)果顯示, IM和SU組的ATP含量于48h明顯

8、降低,約為對(duì)照組含量的50%,72h含量繼續(xù)下降,只有對(duì)照組含量的20%;LDH的釋放量在48h IM和SU顯著升高,72h釋放量繼續(xù)升高,IM組是對(duì)照組的兩倍,SU組是對(duì)照組的三倍。MMP測(cè)量顯示,在24h,IM和SU組MMP均明顯降低,IM組降低到對(duì)照組的50%,SU組降低到對(duì)照組30%,48、72h MMP呈繼續(xù)降低趨勢(shì)。
  上述結(jié)果表明,在離體培養(yǎng)NRVMs上,IM和SU能夠產(chǎn)生明顯心肌細(xì)胞毒性,并且毒性呈現(xiàn)濃度依賴性和

9、時(shí)間依賴性,從檢測(cè)的指標(biāo)上看,線粒體膜電位的下降是最早出現(xiàn)的毒性表現(xiàn)。
  (2)非選擇性PKC抑制劑Bis-1對(duì)IM和SU毒性的影響在NRVMs中,Bis-1(100nM)分別與IM(2、5、10μM),和SU(1、5、10μM),孵育48h檢測(cè)ATP含量,孵育72h檢測(cè)LDH釋放量。單獨(dú)孵育Bis-1上述指標(biāo)與對(duì)照組無明顯差別,而加入Bis-1使三個(gè)濃度下IM和SU組的ATP含量和LDH釋放量均恢復(fù)到對(duì)照組水平;單獨(dú)孵育Bis

10、-1對(duì)MMP無明顯影響,Bis-1與IM或SU共孵育可顯著逆轉(zhuǎn)所有濃度MMP值的下降。透射電鏡掃描結(jié)果顯示,IM和SU引發(fā)線粒體形態(tài)發(fā)生顯著變化,多數(shù)線粒體產(chǎn)生空泡、腫脹或髓樣化改變。而共同孵育Bis-1的IM和SU組細(xì)胞中線粒體恢復(fù)正常形態(tài)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,非選擇PKC抑制劑Bis-1對(duì)IM、SU導(dǎo)致的心肌細(xì)胞毒性有拮抗作用。
  (3)選擇性PKC抑制劑或抑制肽對(duì)IM和SU毒性的影響G(o)6976是cPKC抑制劑,G(o)

11、6976(100 nM)與IM或SU共孵育并不影響MMP值、 ATP含量以及LDH的釋放。同樣,高選擇性PKCα抑制肽(500 nM)對(duì)IM和SU引發(fā)的上述指標(biāo)改變無明顯影響,表明傳統(tǒng)型PKC亞型抑制不能對(duì)抗IM和SU引起的心肌細(xì)胞毒性。Rotterlin是PKCδ選擇性抑制劑,單獨(dú)孵育Rotterlin(500 nM)不影響MMP值、ATP含量以及LDH的釋放,但Rotterlin可完全取消IM和SU引起的上述各項(xiàng)指標(biāo)的變化。選擇性P

12、KCε抑制肽(500 nM)亦可顯著對(duì)抗IM和SU導(dǎo)致的各項(xiàng)指標(biāo)的變化,而其亂碼對(duì)照肽不能對(duì)抗IM或SU導(dǎo)致的各項(xiàng)指標(biāo)的變化,表明選擇性抑制新型PKCδ和PKCε對(duì)IM和SU的心肌細(xì)胞毒性具有明顯預(yù)防作用。
  為進(jìn)一步確認(rèn)Rotterlin和PKCε抑制肽預(yù)防心肌毒性的作用,我們利用透射電子顯微鏡檢測(cè)了細(xì)胞線粒體亞顯微結(jié)構(gòu)。與IM引發(fā)的線粒體改變明顯不同的是,Rotterlin與IM共孵育線粒體亞顯微結(jié)構(gòu)清晰,未見明顯空泡、腫脹

13、或髓樣化改變;PKCε抑制肽存在下,IM雖然引發(fā)部分線粒體空泡化,但未見髓樣化改變。Rotterlin和PKCε抑制肽對(duì)SU引發(fā)線粒體改變具有與IM相似的保護(hù)作用。
  以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,選擇性抑制PKCδ和ε亞型能夠一定程度上預(yù)防IM和SU的心肌細(xì)胞毒性,而傳統(tǒng)型PKC亞型抑制不能對(duì)抗IM和SU引起的心肌細(xì)胞毒性。
  結(jié)論:
  (1)IM SU能夠?qū)е碌男募〖?xì)胞毒性,并且毒性呈現(xiàn)濃度依賴性和時(shí)間依賴性,線粒體膜電

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