蛋白激酶C抑制劑對抗伊馬替尼和蘇尼替尼導(dǎo)致的心肌細胞毒性.pdf

1、蛋白激酶在多種疾病，特別是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，以其為藥物靶點的酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors，TKIs）則成為近年藥物研發(fā)的熱點。已上市藥物已經(jīng)在多種腫瘤的治療中顯示出其較傳統(tǒng)治療藥物的優(yōu)越性，部分已成為治療腫瘤的一線用藥。但是隨著這些藥物的應(yīng)用，其不良反應(yīng)也逐漸暴露出來，其中較為嚴(yán)重的是心臟毒性。TKIs引起的心臟毒性主要表現(xiàn)為慢性充血性心力衰竭，一經(jīng)發(fā)生，對患者健康將造成嚴(yán)重影響。因

2、此，研究TKIs導(dǎo)致的心臟毒性機制及其有效對抗藥物顯得尤為重要。
　　臨床已經(jīng)報道具有心臟毒性的TKIs藥物有伊馬替尼，蘇尼替尼，尼羅替尼，達沙替尼等，實驗研究顯示，在離體培養(yǎng)心肌細胞和整體動物模型上，伊馬替尼(Imatinib，IM)和蘇尼替尼(sunitinib，SU)均可導(dǎo)致明顯線粒體功能異常，目前引起上述線粒體損傷的細胞內(nèi)分子機制尚不清楚，有實驗表明伊馬替尼會誘導(dǎo)離體培養(yǎng)的新生大鼠心室肌細胞（NRVMs）中PKCδ表達水平

3、明顯增加[12]。已知蛋白激酶C(proteinkinase C，PKC)是一類絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，在跨膜信號傳遞過程中起重要作用，能夠調(diào)節(jié)細胞的代謝、生長、增殖和分化等。迄今，已鑒定出至少10種PKC亞型（異構(gòu)體），依據(jù)它們的結(jié)構(gòu)與激活機制分為三類:傳統(tǒng)型PKC（cPKC，包括α、βⅠ、βⅡ和γ），新型PKC（nPKC，包括δ、ε、π和θ），非典型PKC（aPKC，包括ζ、ι/λ）。在近幾年的研究中，發(fā)現(xiàn)PKC各亞型的過度激活參與

4、了各種心臟疾病[20,31]。有研究表明，激活PKCδ會導(dǎo)致線粒體丙酮酸脫氫酶激酶激活，這抑制了丙酮酸脫氫酶和ATP再生并且還會觸發(fā)細胞壞死[12,13，10];因此，我們假定，PKC過度激活可能是此類藥物產(chǎn)生心肌細胞毒性的重要途徑。為驗證我們的假設(shè)，本實驗利用離體培養(yǎng)的新生大鼠心肌細胞(NRVMs)，研究PKC抑制劑或抑制肽（主要研究心肌中富含的cPKCs和nPKCs中的PKCδ、ε亞型）對TKIs藥物伊馬替尼(Imatinib，IM

5、)和蘇尼替尼(Sunitinib，SU)導(dǎo)致的心肌細胞毒性作用的影響。研究對闡明TKIs類藥物心臟毒性機制、防治心臟毒性提供實驗依據(jù)。
　　目的:研究cPKCs和PKCδ、ε亞型抑制劑或抑制肽對IM和SU導(dǎo)致的心肌細胞毒性作用的影響。
　　方法:新生1-2天SD大鼠，分離心室肌細胞，用DMEM/F-12培養(yǎng)基培養(yǎng)三天，首先分別孵育不同濃度的IM（2、5、10μM）和SU（1、5、10μM），在48h用ATP檢測試劑盒和FLU

6、Ostar Omega全自動多功能酶標(biāo)儀檢測細胞內(nèi)ATP的含量，72h用LDH檢測試劑盒和FLUOstar Omega全自動多功能酶標(biāo)儀檢測細胞外LDH釋放量，線粒體膜電位檢測試劑盒和激光共聚焦顯微鏡檢測線粒體膜電位(MMP)的改變。然后，觀察非選擇性、選擇性PKC抑制劑或抑制肽對IM和SU細胞毒性的影響。實驗數(shù)據(jù)均用OriginPro8.6進行數(shù)據(jù)分析，采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，n代表實驗重復(fù)次數(shù)。兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，P＜0.05

7、時認為兩組間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　(1)IM和SU對NRVMs的毒性作用不同濃度IM（2、5、10μM）和SU（1、5、10μM）與NRVMs孵育48h細胞內(nèi)ATP含量呈濃度依賴性減少，72h檢測的LDH釋放量亦隨著濃度的增加而明顯增多。
　　分別孵育10μM的IM和SU，于24、48及72h三個時間點檢測細胞內(nèi)ATP的含量，LDH釋放量以及MMP變化。結(jié)果顯示， IM和SU組的ATP含量于48h明顯

8、降低，約為對照組含量的50％，72h含量繼續(xù)下降，只有對照組含量的20％;LDH的釋放量在48h IM和SU顯著升高，72h釋放量繼續(xù)升高，IM組是對照組的兩倍，SU組是對照組的三倍。MMP測量顯示，在24h，IM和SU組MMP均明顯降低，IM組降低到對照組的50％，SU組降低到對照組30％，48、72h MMP呈繼續(xù)降低趨勢。
　　上述結(jié)果表明，在離體培養(yǎng)NRVMs上，IM和SU能夠產(chǎn)生明顯心肌細胞毒性，并且毒性呈現(xiàn)濃度依賴性和

9、時間依賴性，從檢測的指標(biāo)上看，線粒體膜電位的下降是最早出現(xiàn)的毒性表現(xiàn)。
　　(2)非選擇性PKC抑制劑Bis-1對IM和SU毒性的影響在NRVMs中，Bis-1(100nM)分別與IM（2、5、10μM），和SU(1、5、10μM)，孵育48h檢測ATP含量，孵育72h檢測LDH釋放量。單獨孵育Bis-1上述指標(biāo)與對照組無明顯差別，而加入Bis-1使三個濃度下IM和SU組的ATP含量和LDH釋放量均恢復(fù)到對照組水平;單獨孵育Bis

10、-1對MMP無明顯影響，Bis-1與IM或SU共孵育可顯著逆轉(zhuǎn)所有濃度MMP值的下降。透射電鏡掃描結(jié)果顯示，IM和SU引發(fā)線粒體形態(tài)發(fā)生顯著變化，多數(shù)線粒體產(chǎn)生空泡、腫脹或髓樣化改變。而共同孵育Bis-1的IM和SU組細胞中線粒體恢復(fù)正常形態(tài)。上述實驗結(jié)果表明，非選擇PKC抑制劑Bis-1對IM、SU導(dǎo)致的心肌細胞毒性有拮抗作用。
　　(3)選擇性PKC抑制劑或抑制肽對IM和SU毒性的影響G(o)6976是cPKC抑制劑，G(o)

11、6976(100 nM)與IM或SU共孵育并不影響MMP值、 ATP含量以及LDH的釋放。同樣，高選擇性PKCα抑制肽(500 nM)對IM和SU引發(fā)的上述指標(biāo)改變無明顯影響，表明傳統(tǒng)型PKC亞型抑制不能對抗IM和SU引起的心肌細胞毒性。Rotterlin是PKCδ選擇性抑制劑，單獨孵育Rotterlin(500 nM)不影響MMP值、ATP含量以及LDH的釋放，但Rotterlin可完全取消IM和SU引起的上述各項指標(biāo)的變化。選擇性P

12、KCε抑制肽（500 nM）亦可顯著對抗IM和SU導(dǎo)致的各項指標(biāo)的變化，而其亂碼對照肽不能對抗IM或SU導(dǎo)致的各項指標(biāo)的變化，表明選擇性抑制新型PKCδ和PKCε對IM和SU的心肌細胞毒性具有明顯預(yù)防作用。
　　為進一步確認Rotterlin和PKCε抑制肽預(yù)防心肌毒性的作用，我們利用透射電子顯微鏡檢測了細胞線粒體亞顯微結(jié)構(gòu)。與IM引發(fā)的線粒體改變明顯不同的是，Rotterlin與IM共孵育線粒體亞顯微結(jié)構(gòu)清晰，未見明顯空泡、腫脹

13、或髓樣化改變;PKCε抑制肽存在下，IM雖然引發(fā)部分線粒體空泡化，但未見髓樣化改變。Rotterlin和PKCε抑制肽對SU引發(fā)線粒體改變具有與IM相似的保護作用。
　　以上實驗結(jié)果表明，選擇性抑制PKCδ和ε亞型能夠一定程度上預(yù)防IM和SU的心肌細胞毒性，而傳統(tǒng)型PKC亞型抑制不能對抗IM和SU引起的心肌細胞毒性。
　　結(jié)論:
　　(1)IM SU能夠?qū)е碌男募〖毎拘?，并且毒性呈現(xiàn)濃度依賴性和時間依賴性，線粒體膜電