應(yīng)用“decoy”技術(shù)靶向性阻斷Stat3對(duì)乳腺癌細(xì)胞系增殖抑制的研究.pdf

1、目的 乳腺癌是嚴(yán)重危害女性健康的常見惡性腫瘤之一，有報(bào)道乳腺癌已經(jīng)成為全球女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，隨著國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人民生活水平提高，我國(guó)乳腺癌的發(fā)病率和死亡率都呈迅猛上升態(tài)勢(shì)，在部分城市已上升為女性惡性腫瘤的第一位。乳腺癌的主要治療手段包括手術(shù)、放療、化療和內(nèi)分泌治療，這些治療手段盡管緩解了患者的痛苦，但是其療效及生存質(zhì)量仍有待于提高，各國(guó)學(xué)者也在致力于探尋各種更有效的治療方法。近年來(lái)，腫瘤的基因治療研究逐漸增多，主要方向在

2、于尋找腫瘤基因治療的特異性有效靶點(diǎn)，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)，這為乳腺癌的治療開辟了一個(gè)新天地。 越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，惡性腫瘤存在異?；罨男盘?hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(SignaltransducersandactivatorsoftranscriptionStat)，它們是潛在的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，如果過(guò)度激活及表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的過(guò)度放大，很可能抵抗凋亡，發(fā)生癌變。尤其是Stat3，它在細(xì)胞增殖和分化中起重要作用。在許多血液和組織癌癥中，

3、Stat3是持續(xù)激活的，Stat3的過(guò)表達(dá)使目的基因表達(dá)失調(diào)而使細(xì)胞生長(zhǎng)失控；持續(xù)激活的Stat3上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，誘導(dǎo)腫瘤血管生成，參與腫瘤免疫逃逸，抑制免疫功能。已經(jīng)證實(shí)，Stat3在許多血液和實(shí)體瘤中持續(xù)激活，包括淋巴瘤、白血病、蕈樣肉芽腫、多發(fā)性骨髓瘤、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、頭頸癌、腦瘤、胰腺癌、卵巢癌和胃癌等，因此Stat3可以成為乳腺癌治療的新靶點(diǎn)。 Stat3是調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖的關(guān)鍵因子之一，最近分子生物學(xué)的

4、研究進(jìn)展為抑制目的基因表達(dá)提供了新的技術(shù)，目前已有幾種方法用來(lái)阻斷Stat3，其中包括反義核苷酸、核酸酶、異位表達(dá)顯性失活突變體、干擾RNA、抑制上游激酶、磷酸酪氨?？s氨酸和誘騙寡核苷酸。其中，核酸酶是一類特殊的RNA分子，它不但儲(chǔ)存遺傳信息而且具有催化活性，催化剪切特異目的mRNA而使其降解；小干擾RNA可以與特異mRNA結(jié)合，阻斷它的翻譯而抑制目的基因表達(dá)，是一種很有潛力的治療策略。但是這些RNA分子在體內(nèi)很快就降解，限制了它們的應(yīng)

5、用。這樣DNA技術(shù)的應(yīng)用在調(diào)節(jié)體內(nèi)疾病相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄中具有重要的治療潛力。 轉(zhuǎn)錄因子誘騙技術(shù)是通過(guò)應(yīng)用與靶轉(zhuǎn)錄因子具有高親和性的雙鏈寡聚核酸序列(即decoy-ODN)，競(jìng)爭(zhēng)性抑制轉(zhuǎn)錄因子與調(diào)控區(qū)域的結(jié)合，調(diào)控轉(zhuǎn)錄來(lái)改變下游基因的異常表達(dá)，抑制腫瘤惡性增殖。利用decoy-ODN靶向性阻斷核轉(zhuǎn)錄因子的潛在優(yōu)勢(shì)在于①decoy-ODN序列較短，合成較為簡(jiǎn)便、直接，較易進(jìn)入胞內(nèi)。②decoy-ODN具有較高特異性，能夠很容易的識(shí)別靶

6、蛋白。③避開了對(duì)靶基因在轉(zhuǎn)錄水平上復(fù)雜而又繁瑣的探究，卻又達(dá)到了理想的阻斷效果。已有報(bào)道Stat3decoy-ODN在體外和動(dòng)物體內(nèi)治療頭頸鱗狀上皮細(xì)胞癌和上皮癌已經(jīng)顯示出其有效性，這提示誘騙策略在乳腺癌基因治療中的應(yīng)用潛力。本研究以乳腺癌細(xì)胞系為研究對(duì)象，通過(guò)陽(yáng)離子聚合物介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)染技術(shù)將Stat3decoy-ODN導(dǎo)入乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231與MCF-7后進(jìn)行細(xì)胞學(xué)研究和其作用機(jī)制的探索。 方法 1.We

7、stern印跡方法檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231與MCF-7的Stat3總蛋白表達(dá)水平。 2.核酸-蛋白凝膠電泳遲滯實(shí)驗(yàn)(EMSA)分析Stat3decoy-ODN與Stat結(jié)合能力。 3.用陽(yáng)離子聚合物介導(dǎo)的方法將ODN轉(zhuǎn)染入乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231與MCF-7后，熒光顯微鏡下觀察FITC標(biāo)記的Stat3decoy-ODN在MDA-MB-231與MCF-7的定位。 4.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)FITC標(biāo)記的

8、Stat3decoy-ODN在MDA-MB-231與MCF-7的轉(zhuǎn)染效果。 5.細(xì)胞計(jì)數(shù)法與MTT法分析MDA-MB-231與MCF-7細(xì)胞增殖能力。 6.轉(zhuǎn)染Stat3decoy-ODN后，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析MDA-MB-231與MCF-7細(xì)胞周期。 7.RT-PCR方法分析Stat3decoy-ODN對(duì)凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的影響。 8.Western印跡方法分析Stat3decoy-ODN對(duì)凋

9、亡相關(guān)基因蛋白表達(dá)水平的影響。 9.FACS檢測(cè)凋亡相關(guān)基因蛋白表達(dá)水平 結(jié)果 1.Westernblot法檢測(cè)Stat3總蛋白表達(dá)水平 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231與MCF-7細(xì)胞，提取總蛋白，進(jìn)行WesternBlot分析發(fā)現(xiàn)，這兩個(gè)細(xì)胞系Stat3與Phospho—Stat3(Try-705、Ser-727)的蛋白水平均有較高表達(dá)，MDA-MB-231表達(dá)水平相對(duì)較高。 2.Stat

10、3decoy-ODN與Stat結(jié)合能力 EMSA結(jié)果顯示：32P標(biāo)記的Stat3decoy-ODN與MDA-MB-231與MCF-7的核蛋白抽提物孵育，在垂直凝膠電泳后掃描發(fā)現(xiàn)了寡核苷酸與蛋白的結(jié)合帶，而32P標(biāo)記的核苷酸隨機(jī)序列(Scramble)和MDA-MB-231與MCF-7的核蛋白抽提物孵育后未出現(xiàn)這條結(jié)合帶。 3.熒光顯微鏡下觀察FITC標(biāo)記的Stat3decoy-ODN在MDA-MB-231與MCF-7細(xì)胞

11、內(nèi)的定位 MDA-MB-231與MCF-7可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核被DAPI染為藍(lán)色，大部分綠色熒光FITC標(biāo)記的decoy-ODN都進(jìn)入胞漿內(nèi)，部分細(xì)胞核有藍(lán)綠色的疊加，說(shuō)明也有decoy-ODN進(jìn)入了細(xì)胞核。 4.FITC標(biāo)記的Stat3decoy-ODN在MDA-MB-231與MCF-7的轉(zhuǎn)染效果的流式分析結(jié)果 在流式結(jié)果中檢測(cè)到FL1通道呈現(xiàn)陽(yáng)性分布，并且其陽(yáng)性率與Stat3decoy-ODN的濃度成正比。

12、5.Stat3decoy-ODN對(duì)細(xì)胞增殖的影響 轉(zhuǎn)染Stat3decoy-ODN后，對(duì)MDA-MB-231與MCF-7細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，其中Decoy-ODN對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用最為明顯，與空白對(duì)照組比較有顯著性差異，并且隨著decoy-ODN轉(zhuǎn)染濃度的升高，細(xì)胞增殖速率隨之降低；而scramble-ODN與空白對(duì)照組細(xì)胞比較差異無(wú)顯著性意義。 6.Stat3decoy-ODN對(duì)細(xì)胞周期的影響 Stat3decoy

13、-ODN轉(zhuǎn)染MDA-MB-231與MCF-7細(xì)胞24后，可見兩細(xì)胞的G1期細(xì)胞比率明顯上升，而S期比率明顯降低。 7.Stat3decoy-ODN對(duì)凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的影響 Stat3decoy-ODN轉(zhuǎn)染細(xì)胞后Bcl-x1，C-myc，CyclinD1mRNA表達(dá)水平顯著低于空白對(duì)照組細(xì)胞，而Scramble-ODN組細(xì)胞以上各種基因的mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組細(xì)胞相比無(wú)明顯差異。 8.Stat3dec

14、oy-ODN對(duì)凋亡相關(guān)基因蛋白表達(dá)的Western結(jié)果 Stat3decoy-ODN轉(zhuǎn)染細(xì)胞后Bcl-x1，CyclinD1蛋白表達(dá)水平顯著低于空白對(duì)照組細(xì)胞，而Scramble-ODN組細(xì)胞以上各種基因的蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組細(xì)胞相比無(wú)明顯差異。 9.Stat3decoy-ODN對(duì)凋亡相關(guān)基因蛋白表達(dá)的流式結(jié)果 Stat3decoy-ODN轉(zhuǎn)染細(xì)胞后應(yīng)用流式胞內(nèi)染色Bcl-2，發(fā)現(xiàn)其蛋白表達(dá)水平顯著低于空白對(duì)照組

15、細(xì)胞，而Scramble-ODN組細(xì)胞無(wú)明顯差異。 結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Stat3表達(dá)陽(yáng)性的MDA-MB-231與MCF-7細(xì)胞作為研究對(duì)象，通過(guò)核酸-蛋白凝膠電泳遲滯實(shí)驗(yàn)(EMSA)證明Stat3decoy-ODN與Stat有較高的結(jié)合能力。通過(guò)陽(yáng)離子聚合物介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)染技術(shù)將Stat3decoy-ODN和scrambleODNs核酸對(duì)照成功的導(dǎo)入乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231與MCF-7中，檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染Stat

16、3decoy-ODN后MDA-MB-231細(xì)胞的增殖活性明顯低于scrambleODNS組和空白對(duì)照組細(xì)胞。進(jìn)一步研究證明，Stat3decoy-ODN明顯降低細(xì)胞的S期，提示Stat3decoy-ODN能夠抑制乳腺癌細(xì)胞系的增殖，促進(jìn)其凋亡STAT3調(diào)控的抗凋亡和細(xì)胞周期相關(guān)基因蛋白表達(dá)水平均在Stat3decoy-ODN組細(xì)胞明顯低于對(duì)照組細(xì)胞和Scramble組細(xì)胞，這表明了Stat3decoy-ODN并非由于本身的核苷酸毒性影響