RNAi沉默STAT3基因對乳腺癌細胞生長抑制的體內外研究.pdf

1、目的：STAT3(signal transducer and activator of transcription3)是一種雙功能蛋白，存在于細胞質中，并與酪氨酸磷酸化的信號通路相偶聯，是JAK-STAT途徑中一種重要的底物，在信號轉導和轉錄過程中具有關鍵性作用；在許多體內外實驗中發(fā)現，STAT3可以調控許多種致瘤的信號通路。STAT3還可以通過EGFR，Src，IL-6等生長因子、細胞因子的激活，使其DNA的結合活性上調，調控相應靶基

2、因的轉錄。并且不斷將生存信號向腫瘤細胞轉導，發(fā)揮促進腫瘤細胞生存、抑制細胞凋亡的作用。EGFR,Src等受體和非受體酪氨酸激酶是VEGF的主要誘導因素，而這些酪氨酸激酶信號是通過多種途徑傳遞的，STAT3則是這些路徑的一個交匯點，可以直接參與調節(jié)VEGF的表達，調控血管的生成。STAT3信號通路與細胞的分化、增殖、血管生成、凋亡、免疫逃逸和侵襲轉移密切相關。STAT3通路持續(xù)的激活可引起細胞異常增殖及惡性轉化。
　　 在我國，乳

3、腺癌呈逐年上升趨勢，在部分大城市占女性惡性腫瘤之首，外科治療歷史悠久，但治療效果并無突破性改善，生物治療被譽為乳腺癌治療的曙光。乳腺癌是一個多突變、多因素積累的過程，乳腺癌的病因及發(fā)病機理目前尚不十分清楚，隨著近年來分子生物學領域的迅猛發(fā)展，在分子水平上，人們對乳腺癌的發(fā)病機制及治療的探討也更加廣泛，而且也取得了一定成果。目前，與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及轉移過程有關蛋白的異常激活或過度表達的研究更加受到人們關注。研究發(fā)現在多種人類惡性腫瘤中

4、都有Stat3的過度激活，沉默Stat3的表達能夠有效抑制腫瘤的增殖和生長。
　　 RNAi技術是指在生物體內經由雙鏈RNA介導其同源序列mRNA發(fā)生的特異性降解，進而引起基因沉默?？梢葬槍π盘柾分械亩鄠€基因或基因簇所共同具有的序列，使多個基因的表達同時被抑制，從而更有效地發(fā)揮抑制腫瘤生長的作用。RNAi是一種快捷，高效的技術手段，可特異性地抑制基因的表達，為腫瘤的基因治療研究提供了有力的方法。目前在分子生物學研究中RNAi是

5、最為活躍的熱點之一。
　　 在本研究中，在用免疫組化法檢測STAT3及pSTAT3在乳腺癌中的表達情況后，我們利用RNA干擾技術，以STAT3siRNA轉染人乳腺癌MCF7細胞，用Western blot及RT-PCR檢測STAT3siRNA對STAT3mRNA和蛋白表達的抑制，并觀察STAT3siRNA對MCF7細胞增殖和凋亡的作用。進一步進行裸鼠移植瘤動物實驗，并檢測移植瘤中STAT3mRNA和蛋白表達受抑制的情況，來進一步

6、驗證體外實驗中的發(fā)現，為乳腺癌的基因治療提供理論基礎。
　　 方法：本課題主要研究乳腺癌中STAT3的異常表達，并應用RNA干擾技術沉默STAT3在乳腺癌細胞的表達，觀察其對乳腺癌惡性表型的影響。實驗主要分三部分：
　　 第一部分中采用免疫組織化學方法，對36例乳腺癌臨床標本和10例正常乳腺組織標本進行檢測，初步篩選和驗證STAT3蛋白的異常表達情況，觀察STAT3蛋白在乳腺癌組織及正常乳腺組織中的表達情況，探討STAT

7、3異常表達與乳腺癌患者臨床及病理特征之間的關系，研究STAT3表達對乳腺癌患者臨床診斷及預后的意義。
　　 第二部分主要是STAT3siRNA轉染乳腺癌MCF7細胞的體外實驗。應用RNA干涉技術以脂質體轉染試劑介導STAT3siRNA靶向轉染人乳腺癌MCF7細胞系后，采用TR-PCR檢測STAT3基因的沉默情況，進一步用Western blot技術檢測了RNAi沉默STAT3基因表達后，STAT3蛋白表達的變化。再用MTT方法檢

8、測STAT3siRNA轉染前后細胞增殖能力的變化，用流式細胞檢測技術分析了轉染前后細胞凋亡情況的改變。
　　 第三部分中，首先將STAT3siRNA體外轉染乳腺癌MCF7細胞系，于裸鼠皮下注射轉染后的細胞，建立裸鼠乳腺癌皮下移植瘤動物模型，動態(tài)觀察荷瘤鼠體內腫瘤生長情況，接種瘤細胞后第4天，各組均出現肉眼可見瘤體，開始測量荷瘤鼠腫瘤大小，每3天1次測量并記錄腫瘤的長徑(L)和短徑(w)，共測7次，計算腫瘤體積。依據記錄數據繪制裸

9、鼠的腫瘤生長曲線。接種第7天，每組各取3只荷瘤鼠頸椎脫臼處死，完整剝離腫塊，分別用RT-PCR.及Westem blot檢測腫塊中STAT3 mRNA及STAT3蛋白的變化，對體外實驗的結果進一步驗證。其余每組5只繼續(xù)觀察。接種22天后，頸椎脫臼處死全部裸鼠，迅速剪開皮膚，完整剝離腫塊并稱重。并對處死的荷瘤鼠及剝離的腫塊進行拍照。
　　 結果：
　　 1 STAT3與pSTAT3在乳腺癌中的表達檢測結果顯示：
　　

10、 STAT3陽性表達部位主要位于胞漿，呈棕黃染色。pSTAT3陽性表達部位主要位于細胞核，呈棕黃色。乳腺癌組織中STAT3、pSTAT3蛋白的高表達率分別為58.30％、55.56％。正常乳腺組織中分別為10％、0％。乳腺癌組陽性率顯著高于正常乳腺組(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。在乳腺癌中STAT3、pSTAT3陽性細胞率與乳腺癌的臨床分期及淋巴結轉移之間有相關性，在臨床分期高及有淋巴結轉移的病例中，STAT3、pSTAT3蛋白

11、表達陽性率高(P＜0.05);STAT3蛋白在癌組織中的表達與年齡和腫瘤大小、病理類型均無明顯關系(P＞0.05)。
　　 2 Stat3iRNA對乳腺癌MCF7細胞生長抑制的體外實驗結果顯示：STAT3 mRNA檢測結果：從條帶顯示上看，STAT3siRNA轉染組STAT3mRNA的表達量較空白對照組及非特異siRNA轉染組在48h時明顯減少，非特異siRNA轉染組的表達量與空白對照組無明顯差異。定量分析結果( STAT3/β

12、-actin)顯示： STAT3siRNA轉染組（24h0.664±0.007，48h0.327±0.020）較空白對照組（1.093±0.018）及非特異siRNA轉染組(24h1.026±0.04848h1.035±0.050)明顯減少，48h值最低(P＜0.05)。非特異siRNA轉染組與空白對照組沒有明顯差別(P＞0.05)。各組細胞經Western blot檢測分析顯示，內參照actin為均一顯影的條帶，而STAT3顯影條帶密

13、度不同．其中，非特異siRNA轉染組與空白對照組細胞STAT3表達量較高，而STAT3siRNA轉染組細胞STAT3表達量顯著下降，在72h時最明顯。吸光度值分析(STAT3/β-actin)結果顯示：STAT3siRNA轉染組（48h1.258±0.017，72h0.153±0.006）較空白對照組（1.374±0.022）及非特異siRNA轉染組(48h1.391±0.051，72h1.320±0.033)明顯減少，72h值最低(P

14、＜0.05)。而非特異siRNA轉染組與空白對照組沒有明顯差別(P＞0.05)；從MTT檢測結果表明，STAT3siRNA轉染組腫瘤細胞A490nm的吸光值明顯減少，增殖能力于48h及72h后明顯下降，與空白對照組及非特異siRNA轉染組相比較，細胞生長受到明顯抑制(P＜0.05)。其生長抑制率，STAT3siRNA轉染組較空白對照組及非特異siRNA轉染組明顯增高(P＜0.05)。表明Stat3 siRNA具有抑制乳腺癌細胞增殖的能力

15、．流式細胞儀分析顯示，STAT3siRNA轉染組細胞凋亡率為14.79±0.22，明顯高于空白對照組及非特異siRNA轉染組(P＜0.01)；而空白對照組及非特異siRNA轉染組間凋亡率無顯著性差異(P＞0.05)。STAT3siRNA轉染組出現明顯的凋亡峰AH，而空白對照組及非特異siRNA轉染組均未見明顯凋亡峰。
　　 3 STAT3siRNA對MCF7細胞裸鼠皮下移植瘤的抑制作用實驗結果顯示：
　　 成瘤情況：非特

16、異siRNA-MCF7和STAT3siRNA-MCF7細胞分別接種于裸鼠背部皮下，經過4d后在其接種部位形成肉眼可見的腫瘤結節(jié)，至第22天觀察結束時，空白對照組、非特異siRNA轉染組的體積及瘤重明顯大于STAT3siRNA轉染組(P＜0.05)．而空白對照組、非特異siRNA轉染組的體積及瘤重無明顯差異(P＞0.05)。空白對照組、非特異siRNA-MCF7轉染組裸鼠的營養(yǎng)狀況明顯差于STAT3 siRNA轉染組。連續(xù)觀察裸鼠背部移植

17、瘤的生長情況，從第四天開始，每3天測量一次每只裸鼠腫瘤的長徑及短徑，共測七次，繪制各組裸鼠腫瘤的生長曲線圖。結果顯示，隨著時間的推移，3組腫瘤的生長速度明顯不同，空白對照組、非特異siRNA轉染組的生長速度明顯快于STAT3 siRNA轉染組．空白對照組、非特異siRNA轉染組的生長速度較接近。瘤細胞STAT3 mRNA檢測結果：STAT3siRNA轉染組STAT3 mRNA的表達水平（條帶窄小，密度低）較空白對照組及非特異siRNA轉

18、染組明顯減低，非特異siRNA轉染組的STAT3 mRNA表達水平與空白對照組近似。定量分析(STAT3/actin)結果顯示，STAT3siRNA轉染組（0.743±0.093）較空白對照組（1.106±0.039）及非特異siRNA轉染組（1.016±0.111）明顯減低(P＜0.05)。而非特異siRNA轉染組與空白對照組沒有明顯差別(P＞0.05)。各組移植瘤經Western blot檢測分析顯示，內參照actin為均一顯影的條

19、帶，而STAT3顯影條帶密度不同．其中，非特異siRNA轉染組與空白對照組STAT3表達量較高，而STAT3siRNA轉染組細胞STAT3表達量顯著下降（條帶密度明顯降低）．定量分析(STAT3/actin)結果顯示，STAT3siRNA轉染組（0.839±0.274）較空白對照組（1.034±0.101）及非特異siRNA轉染組（0.963±0.075）明顯減低(P＜0.05)。而非特異siRNA轉染組與空白對照組沒有明顯差別(P＞0

20、.05)。
　　 結論：
　　 1 STAT3、pSTAT3蛋白在乳腺癌組織中呈高表達，且與腫瘤TNM分期和淋巴結轉移情況有關，TNM分期較晚的和有淋巴結轉移的呈顯著高表達。STAT3檢測可作為乳腺癌的輔助診斷的一個指標。
　　 2 STAT3siRNA能夠有效沉默STAT3基因，下調MCF7細胞系中STAT3mRNA及蛋白的表達，使細胞凋亡增加，細胞增殖能力明顯下降。明顯抑制乳腺癌MCF7細胞的體外生長。