沉默STAT3的表達(dá)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞生長和遷移的影響.pdf

1、世界上80％的鼻咽癌患者出現(xiàn)在我國廣東省。幾乎100％的鼻咽癌都與EBV有關(guān)。EBV是一類能引起上皮感染的人皰疹病毒，最終可以導(dǎo)致鼻咽癌發(fā)生發(fā)展。95％的鼻咽癌患者臨床組織分型為低分化鱗癌或者未分化癌，目前鼻咽癌的治療主要采用放療為主結(jié)合化療、免疫治療及手術(shù)治療等的綜合療法，放療是其主要的治療手段，但由于放療后易發(fā)生局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，以及鼻咽癌細(xì)胞對(duì)化療藥物不敏感和化療藥物的嚴(yán)重毒副作用，從而影響了預(yù)后，并限制了進(jìn)一步提高患者生存率.

2、因此，從基因治療的角度，尋找毒性低、療效好、特異性強(qiáng)的新的治療技術(shù)具有重要的臨床意義。 STAT3(signal transducer and activator of transcription3)是一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子，是STAT家族的一員。它能通過各種細(xì)胞因子(如：IL—6)和生長因子(如：表皮生長因子，EGF)的活化將信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鬟f到核內(nèi)。在正常生理?xiàng)l件下，STAT3二聚化后轉(zhuǎn)位到核內(nèi)，誘導(dǎo)重要基因的表達(dá)，這

3、些基因參與細(xì)胞的正常生理代謝，包括細(xì)胞增殖，存活和發(fā)展，且STAT3蛋白的這種活化是迅速而短暫的。在人類很多腫瘤細(xì)胞中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有STAT3的持續(xù)活化，包括：多發(fā)性骨髓瘤，乳腺癌，肺癌，白血病，胃癌，淋巴癌等。特別是，在EBV相關(guān)的人腫瘤中觀察到STAT3的異?；罨@為探討其在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展中的作用奠定了基礎(chǔ)。 STAT3參與腫瘤發(fā)生可以通過如下兩個(gè)機(jī)制：一是通過上調(diào)編碼凋亡抑制因子(survivin和Bcl—xl)、細(xì)胞周

4、期調(diào)節(jié)因子(cyclinsD1/D2和c—Myc)的基因，打破細(xì)胞周期增長和凋亡之間的平衡，促進(jìn)腫瘤生長。二是通過影響細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，促進(jìn)細(xì)胞遷移。因此，本研究通過構(gòu)建STAT3 RNA干擾的重組質(zhì)粒，沉默STAT3蛋白在CNE—2細(xì)胞中的表達(dá)，觀察其對(duì)細(xì)胞增殖和遷移的影響，并探討可能的機(jī)制，為進(jìn)一步研究STAT3在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用提供新的思路和理論基礎(chǔ)。 主要研究方法和結(jié)果如下： 1.構(gòu)建由RNA干擾載體pSlience

5、r2.0-U6介導(dǎo)的STAT3干擾載體。在STAT3的mRNA鏈上分別選定3個(gè)不同位點(diǎn)作為干擾的目標(biāo)序列，化學(xué)合成寡核苷酸，在限制性酶切位點(diǎn)BamHI和HindⅢ之間插入干擾序列獲得STAT3 shRNA表達(dá)體。測序及酶切結(jié)果表明重組載體構(gòu)建成功。 2.RT—PCR法檢測STAT3在多種腫瘤細(xì)胞中mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)在鼻咽癌細(xì)胞株中，只有EB病毒陽性來源的細(xì)胞株CNE—2和SUNE-1能檢測到STAT3的高表達(dá)，而E

6、B病毒陰性來源的鼻咽癌細(xì)胞株CNE-1中STAT3的表達(dá)水平幾乎檢測不到。脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染STAT3 shRNA干擾載體到人鼻咽癌細(xì)胞株CNE—2中。RT—PCR以及Western blot法檢測STAT3在細(xì)胞中mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)水平。 3.觀察沉默STAT3對(duì)CNE—2細(xì)胞生長的影響。MTT法繪制細(xì)胞的生長曲線，Hoechst33258染色以及通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率的改變。MTT實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)及Hoechst33

7、258染色法均證實(shí)沉默STAT3能抑制細(xì)胞生長，細(xì)胞死亡率升高，細(xì)胞周期停滯在G0/G1期到S期。 4.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察STAT3對(duì)CNE—2細(xì)胞的遷移促進(jìn)作用。脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染STAT3 RNA干擾載體到人鼻咽癌CNE—2細(xì)胞株中，通過細(xì)胞劃痕法觀察到沉默STAT3能抑制細(xì)胞遷移能力。 5.Western blot檢測Bcl—2、Survivin和c—Myc。下調(diào)STAT3的表達(dá)誘導(dǎo)CNE—2細(xì)胞對(duì)凋亡的敏感性，Weste

8、rn blot檢測在此過程中Bcl—2及Survivin上調(diào)受到抑制，并且細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子，C—Myc的上調(diào)也受到抑制。 結(jié)論及研究意義： 1.構(gòu)建了高效抑制STAT3蛋白表達(dá)的RNA干擾載體； 2.抑制STAT3的表達(dá)能促進(jìn)入鼻咽癌CNE—2細(xì)胞的凋亡，抑制細(xì)胞遷移，為鼻咽癌治療的研究提供新的靶點(diǎn)； 3.初步探討了STAT3在人鼻咽癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制。 本研究證實(shí)STAT3只在EB病毒陽