STAT3基因沉默對(duì)人乳腺癌耐藥株MCF-7-ADR阿霉素敏感性的影響及機(jī)制探討.pdf

1、目的:
　　觀察STAT3基因沉默后對(duì)人乳腺癌耐藥細(xì)胞株MCF-7/ADR阿霉素耐藥性的影響，并初步探討其相關(guān)作用機(jī)制。
　　方法:
　　1、MTT法檢測人乳腺癌耐藥細(xì)胞株MCF-7/ADR及其親本細(xì)胞MCF-7的阿霉素半數(shù)抑制濃度(IC50);同時(shí)，Western blot技術(shù)檢測STAT3及p-STAT3蛋白在該兩株細(xì)胞中的表達(dá)差異以及3μg/mL阿霉素干預(yù)MCF-7細(xì)胞12h和36h后STAT3和p-STAT3蛋

2、白的表達(dá)變化。
　　2、將MCF-7/ADR細(xì)胞分為3組，即干擾組:感染STAT3干擾慢病毒顆粒(LV-shRNA-STAT3);陰性對(duì)照組:感染重組無義序列的陰性對(duì)照慢病毒顆粒(LV-shRNA-NC);空白組:不作處理。感染72 h后，1μg/mL嘌呤霉素持續(xù)篩選5天，熒光顯微鏡下觀察慢病毒感染效率。Real-time PCR檢測各組STAT3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量，Western blot檢測各組STAT3、p-STAT3蛋

3、白表達(dá)。
　　3、MTT法檢測各組細(xì)胞的阿霉素IC50;流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測阿霉素干預(yù)48h后各組細(xì)胞的凋亡率和細(xì)胞周期差異;Tunel染色法進(jìn)一步檢測細(xì)胞凋亡指數(shù)。
　　4、進(jìn)一步采用Western blot技術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡相關(guān)基因bcl-2、survivin和c-myc的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1、常規(guī)培養(yǎng)條件下，MCF-7/ADR和MCF-7的阿霉素IC50值分別為(59.37±5.01)μ

4、g/mL、(5.50±0.82)μg/mL，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。STAT3以及p-STAT3蛋白在MCF-7/ADR中的表達(dá)高于MCF-7，并且，一定濃度阿霉素處理MCF-7細(xì)胞不同時(shí)間后，STAT3和p-STAT3蛋白表達(dá)均呈時(shí)間依賴性增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　2、干擾組以及陰性對(duì)照組的慢病毒感染效率均達(dá)到90％以上。與空白組和陰性對(duì)照組比較，干擾組STAT3 mRNA、蛋白以及p-STAT

5、3蛋白表達(dá)顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　3、MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，干擾組、空白組和陰性對(duì)照組細(xì)胞的阿霉素IC50值分別為(7.60±0.20)μg/mL、(56.12±3.01)μg/mL和(54.86±11.91)μg/mL（P＜0.05）。FCM結(jié)果顯示，干擾組、空白組和陰性對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率分別為(34.03±3.14)％、(10.53±0.67)％和(11.70±0.72)％，并且，干擾組S期細(xì)胞比例顯

6、著增多，相應(yīng)地G2/M期和G1期細(xì)胞比例下降（P＜0.05）。Tunnel染色結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)干擾組的細(xì)胞凋亡指數(shù)增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　4、Western blot結(jié)果提示，與空白組和陰性對(duì)照組比較，bcl-2、survivin和c-myc蛋白在干擾組中的表達(dá)水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、通過構(gòu)建重組的STAT3干擾慢病毒(LV-shRNA-STAT3)