RNA干擾阻斷STAT3基因?qū)δ[瘤細胞放射敏感性的影響.pdf

1、是腫瘤臨床治療的一種重要手段，腫瘤細胞的放射敏感性與DNA損傷修復(fù)、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞增殖、凋亡以及細胞周期調(diào)控等最基本的生命活動密切相關(guān)。近年來，利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)阻斷、導(dǎo)入和修飾腫瘤細胞某些信號通路中的關(guān)鍵分子，促進電離輻射誘發(fā)的腫瘤細胞死亡和凋亡，進而提高放療效果，并最大限度減少正常組織細胞損傷的方法已成為腫瘤放射治療研究的熱點之一。 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3(SignalTransducerandActivatoro

2、fTranscription3，STAT3)是一種存在于細胞漿與酪氨酸磷酸化信號通路相耦聯(lián)的具有關(guān)鍵作用的雙功能蛋白。激活后形成二聚體轉(zhuǎn)入細胞核內(nèi)，識別并結(jié)合到靶基因DNA特異的反應(yīng)元件，誘導(dǎo)細胞生長、分化和凋亡等相關(guān)基因的表達。目前研究表明STAT3在腫瘤的形成和發(fā)展過程中起著重要的作用。 本文主要研究RNA干擾(RNAinterference，RNAi)阻斷腫瘤細胞STAT3后，腫瘤輻射敏感性的變化。 研究內(nèi)容選取S

3、TAT3高表達的體外培養(yǎng)人類腫瘤細胞作為研究對象，檢測其胞內(nèi)STAT3蛋白的表達及其磷酸化活化水平； 合成STAT3小干擾RNA(short/smallinterferencingRNA)：采用文獻報道的人類STAT3小干擾RNA序列，化學(xué)合成； 研究STAT3小干擾RNA對人類腫瘤細胞STAT3基因mRNA和蛋白水平表達的影響以及蛋白磷酸化的影響； 觀察STAT3小干擾RNA轉(zhuǎn)染后體外培養(yǎng)腫瘤細胞輻射敏感性的變

4、化并探討其可能的作用機制。 實驗方法用Real-timeRT-PCR和WesternBlot技術(shù)研究人肝癌HepG-2細胞中STAT3的mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達及磷酸化活化水平；脂質(zhì)體包裹STAT3小干擾RNA轉(zhuǎn)染細胞后，通過Real-timeRT-PCR和WesternBlot技術(shù)分別在mRNA水平和蛋白水平上檢測STAT3的表達和/或磷酸化活化水平；研究RNA干擾阻斷STAT3后體外培養(yǎng)人肝癌HepG-2細胞放射敏感性的變化：

5、采用CCK-8(CellCountingKit8)法檢測細胞增殖變化；利用Hoechst33258染色對各種處理因素作用后的細胞作形態(tài)學(xué)觀察，判別凋亡細胞數(shù)量變化的趨勢，研究STAT3小干擾RNA對HepG-2細胞放射敏感性的影響，觀察RNA干擾和電離輻射的協(xié)同效應(yīng)；選取人皮膚成纖維細胞系HSF作為對照進行上述實驗；統(tǒng)計學(xué)分析。 實驗結(jié)果相對于HSF細胞株，人肝癌HepG-2細胞株中STAT3蛋白高水平表達且有一定程度的磷酸化水

6、平升高。 一定濃度siRNA轉(zhuǎn)染后，處理組STAT3的mRNA轉(zhuǎn)錄水平、總蛋白表達及其磷酸化水平發(fā)生明顯降低。 人肝癌HepG-2細胞株中RNA干擾阻斷STAT3后，其放射敏感性顯著增強：CCK-8檢測表明與對照組相比，單純siRNA轉(zhuǎn)染可使腫瘤細胞表現(xiàn)出增殖力下降，而siRNA轉(zhuǎn)染聯(lián)合輻射作用腫瘤細胞增殖受到明顯抑制；DNA染色劑Hoechst33258染色后的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果表明單純siRNA轉(zhuǎn)染組并未出現(xiàn)明顯增多的細

7、胞凋亡的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，但siRNA轉(zhuǎn)染聯(lián)合輻射作用后呈現(xiàn)凋亡形態(tài)學(xué)表現(xiàn)的細胞出現(xiàn)頻率顯著增加；而作為對照的正常細胞中沒有觀察到明顯的放射敏感性增加。 討論正常信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中STAT3的激活是快速而短暫的，STAT3異常高水平表達和持續(xù)性激活與細胞的惡性轉(zhuǎn)化進程密切相關(guān)。STAT3是EGFR、IL-6/JAK、Src等多個致癌性酪氨酸激酶信號通道匯聚的焦點，在多種腫瘤細胞和組織中都有異常激活。本實驗室已有研究表明，在鼠惡性黑色素瘤B16

8、細胞株、人肝癌SMMC-7721、HepG-2細胞株、人肺癌細胞A549及人子宮癌Hela細胞株中均可檢測到STAT3蛋白的高度表達和磷酸化活化。STAT3激活后將誘導(dǎo)一些與細胞增殖、分化、生存及凋亡等密切相關(guān)的關(guān)鍵基因的異常表達，通過多種途徑促進細胞增殖、惡性轉(zhuǎn)化和血管形成并阻礙細胞凋亡，表現(xiàn)出致癌的作用以及對放療、化療等細胞毒性治療的抵抗。 本實驗研究發(fā)現(xiàn)針對STAT3的siRNA序列能夠特異性的和有效的抑制體外培養(yǎng)的人肝癌

9、HepG-2細胞中STAT3蛋白的表達和磷酸化活化，聯(lián)合應(yīng)用STAT3小干擾RNA及電離輻射后，腫瘤細胞表現(xiàn)出較單純應(yīng)用電離輻射更強的增殖抑制，出現(xiàn)典型凋亡形態(tài)學(xué)表現(xiàn)的細胞明顯增多；同時，作為對照的正常細胞(人皮膚成纖維細胞株HSF)中沒有觀察到明顯增強的放射敏感性。我們的研究表明，采用RNA干擾技術(shù)阻斷腫瘤細胞中STAT3蛋白的表達和活化有可能成為一種提高腫瘤細胞放射敏感性和腫瘤放射治療療效的方法，具有一定的臨床應(yīng)用前景。 以

10、往的研究表明STAT3的激活能夠使VEGF表達上調(diào)，阻斷STAT3信號通道，其下游基因Bcl-xL、Mcl-l、c-Myc、cyclinD1也發(fā)生下調(diào)，而這些基因與腫瘤細胞的異常增殖、凋亡抵抗以及放射不敏感性有關(guān)。STAT3特異性的小干擾RNA轉(zhuǎn)染后有效的降低人肝癌HepG-2細胞中STAT3蛋白的表達和活化水平，進而抑制細胞的增殖，促進其凋亡，其機制可能是阻斷STAT3蛋白的表達和活化引起一系列和細胞周期調(diào)控、細胞增殖以及細胞凋亡等相

11、關(guān)的基因如Bcl-xL、Mcl-l、c-Myc、cyclinD1、VEGF、P53等的表達水平改變，進而導(dǎo)致腫瘤細胞的增殖抑制。RNA干擾與輻射聯(lián)合作用后，可以提高輻射引起的腫瘤細胞凋亡。另有研究表明，相對于一些正常細胞，許多腫瘤細胞對STAT3的持續(xù)性高水平表達和激活的依賴性似乎更強，這與我們的研究結(jié)果是相符合的。腫瘤細胞對STAT3的這種依賴性為阻斷STAT3后的放射治療提供了一定的腫瘤細胞特異性，可能提供一種在不增加正常組織放射治