反義STAT3設計及其對肺腺癌A549細胞輻射敏感性影響的研究.pdf

1、本課題選擇近年來國際上高度關注、極有可能成為反義核酸抗腫瘤關鍵作用的sTAT3作為基因靶位，利用RNAstructure 4.2 軟件和網絡資源，模擬STAT3mRNA 二級結構，進一步利用軟件的步移法(oligowalk)模塊設計出一系列反義序列，聯合輻射因素，觀察其對腫瘤輻射敏感性的影響，并以文獻報道的已知序列作為陽性對照，篩選出高效的反義STAT3序列。在此基礎上，探討反義STAT3削弱腫瘤細胞輻射敏感性的相關機制，研究將分子生物

2、學手段與傳統(tǒng)放射治療手段聯合應用治療輻射抗性腫瘤的可行性。 研究內容： 第一，STAT3反義序列的設計：利用RNAstructure 4.2 軟件和網絡資源，模擬STFAT3 mRNA二級結構，進一步利用軟件的步移法(oligowalk)模塊，針對低自由能靶點，設計出一系列反義序列，并合成、修飾增強其穩(wěn)定性。 第二，高效STAT3反義序列的篩選：以文獻報道的已知反義STAT3序列作為陽性對照，對上述反義序列進行篩

3、選，篩選出更高生物學活性的STAT3反義序列。 第三，探討高效反義STAX3轉染后細胞輻射抗性的變化及其作用規(guī)律：將篩選出的高效STAT3反義序列轉染腫瘤細胞后，體外觀察細胞輻射敏感性的變化，尋求其作用規(guī)律。 第四，研究反義STAT3削弱腫瘤細胞輻射敏感性的相關機制：通過觀察細胞的增殖狀態(tài)、凋亡狀況、細胞周期的變化、STAT3表達和活力變化、下游相關基因的表達變化，初步闡明反義STAT3對細胞輻射敏感性的影響的相關機理。

4、 實驗方法：用RNAstructure 4.2軟件和網絡資源，模擬STAT3 mRNA二級結構，進一步利用軟件的步移法(oligowalk)模塊，針對低自由能靶點，設計出一系列反義序列，并合成、修飾增強其穩(wěn)定性，以文獻報道的已知反義STAT3序列作為陽性對照，脂質體包裹各反義序列，在96孔板以200nmol/L濃度為轉染濃度，轉染細胞48h后，用CCK-8實驗方法觀察各序列對腫瘤細胞的增殖抑制效果，篩選出更加高效的反義序列。進一

5、步利用CASY細胞計數分析儀研究高效反義序列對腫瘤細胞的增殖抑制效果，利用Hoeclast33258染色對各種因素作用后的細胞作形態(tài)學上的初步觀察，判別凋亡細胞數量變化的趨勢；用Annexin V/PI復染，流式細胞儀檢測不同因素處理后細胞凋亡百分率的變化，用PI單染分析反義轉染后細胞周期的變化，研究反義STAT3對惡性腫瘤輻射敏感性的改變情況，觀察兩者的協同效應。通過蛋白雜交研究轉染STAT3蛋白表達與活化水平以及相關下游基因的變化，

6、觀察反義序列對蛋白表達和活化的阻斷作用，對反義序列改變腫瘤細胞輻射敏感性的機制作初步的探討。 實驗結果： 1、反義STAT3序列的設計與合成利用先進的反義序列設計軟件，設計得到10條新的反義STAT3序列，分別命名為AS1～AS10，他們的總自由能介于-9.6～-25.8之間，皆明顯低于文獻報道的已知序列ASC。 2、新反義STAT3序列對A549細胞的作用2.1 對腫瘤細胞增殖抑制效果：以文獻報道的已知序列AS

7、C作為陽性對照，CCK-8檢測AS1～AS10各序列對A549細胞的增殖抑制效果。發(fā)現AS5～AS7三個組對A549細胞的增殖抑制效果與ASC組的作用相當，無顯著差異(P>0.05)，其余7組對A549細胞的增殖抑制效果明顯優(yōu)于ASC組(P<0.01)，其中AS10組效果最好，增殖抑制率達75.64％，比ASC組的增殖抑制率提高了近4倍。而AS4與AS8的增殖抑制率也分別達到65.88％、65.97％。 3、不同濃度AS10對A

8、549細胞的增殖抑制效果選擇不同濃度最優(yōu)序列AS10，與已知序列Asc和無義序列NS作A549細胞的增殖抑制效果比較，通過CCK-8檢測計算各組的存活分數，統(tǒng)計結果分析表明：(1)ASlO對A549細胞的增殖抑制效果顯著由于AS10。在50～300nmol/L范圍內，相同濃度的AS10序列的抑制率非常顯著高于相同濃度的ASC序列(JP<0.01)。(2)AS10對A549細胞的增殖抑制效果隨濃度增高而增強。在0到150nmol/L范圍內

9、，反義核酸濃度越高，其增殖抑制效應越強(P<0.01)。 4、反義STAT3轉染聯合輻射作用對A549細胞輻射敏感性的影響 5、反義STAT3對A549細胞抑制作用的機理探討 討論： STAT3是EGFR、IL-6/JAK、Src等多個致癌性酪氨酸激酶信號通道的匯聚的焦點，調節(jié)下游多個靶基因如Bcl-x<,L>、Bcl-2、Mcl-1、c-Myc、VEGF、p<'21WAF\CIP1>、CyclinD1

10、等的表達，在多種腫瘤細胞和組織中都有激活，是近年來備受國內外備受關注的一個重要基因靶點。反義技術研究最重要的是要找準關鍵基因靶點和獲得高效反義寡核苷酸序列。 因此，高效反義STAT3寡核苷酸能夠抑制A549的增殖和促進其凋亡，增加腫瘤細胞的輻射敏感性，有利于在較低的輻射劑量下殺死更多的腫瘤細胞。其機制一方面是反義STAT3寡核苷酸阻斷細胞中STAT3信號通路后，其下游的多種基因表達受到調控，發(fā)生了相應的變化，下調了其下游的抗凋亡

11、基因Bcl-x<,L>等，促進了凋亡的發(fā)生，加上電離輻射對細胞凋亡的誘導作用，兩者聯合應用產生了協同疊加的效應，增加了輻射抗性腫瘤的輻射敏感性。另一方面是反義STAT3下調了細胞周期控制基因，如CyclinD1等，加之輻射導致的DNA損傷，使細胞不能通過G<,1>期的檢查點，發(fā)生周期阻滯，進而對腫瘤細胞進一步產生了增殖抑制效應。由于已有報道說阻斷STAT3對正常的細胞生長的幾乎沒有影響，因此，靶向STAT3蛋白在輻射增敏領域的研究可能具