RGC32基因在肺腺癌中表達(dá)改變的分子機(jī)制及其對肺腺癌A549細(xì)胞化療敏感性的影響.pdf

1、目的：
　　肺癌是呼吸系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，在惡性腫瘤中的死亡率居首位，且呈逐漸上升趨勢，其中腺癌占40％以上。手術(shù)切除配合放、化療是目前治療肺癌的主要手段，但肺癌的高復(fù)發(fā)率、高病死率都是目前治療上存在的難題。所以，加強(qiáng)肺癌發(fā)病原因分子機(jī)制的研究尤為迫切。前期的檢測發(fā)現(xiàn)肺腺癌組織中RGC32基因存在表達(dá)異常。RGC32為重要的補(bǔ)體應(yīng)答基因，在細(xì)胞增殖分化、炎癥反應(yīng)、腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移等過程中起關(guān)鍵作用，從而參與人類許多疾病的發(fā)生發(fā)展過

2、程。本研究擬檢測RGC32基因在肺腺癌組織中的表達(dá)，明確其表達(dá)發(fā)生改變的原因;應(yīng)用RNA干擾技術(shù)沉默肺腺癌A549細(xì)胞中RGC32蛋白的表達(dá)，檢測RGC32沉默對A549細(xì)胞凋亡、細(xì)胞生長抑制率和化療敏感性的影響，并探討p38信號通路在其中發(fā)揮的作用。
　　方法：
　　Real-time PCR檢測32例肺腺癌組織表達(dá)中的RGC32 mRNA表達(dá)。TargetScanHuman5.1等軟件預(yù)測能夠調(diào)控RGC32基因的micr

3、o-RNA，Real-timePCR檢測肺腺癌組織中miR-656表達(dá)。檢測miR-656前體對RGC32基因表達(dá)的影響。應(yīng)用熒光素酶報告基因表達(dá)分析明確miR-656是否與RGC32基因3'UTR結(jié)合，負(fù)性調(diào)控RGC32基因的表達(dá)。
　　應(yīng)用Real-time PCR和Western blot驗(yàn)證siRNA-RGC32對A549細(xì)胞中RGC32基因的沉默效果。應(yīng)用MTT法及流式細(xì)胞儀觀察RGC32基因沉默的A549細(xì)胞增殖情況和

4、細(xì)胞凋亡情況;研究RGC32基因表達(dá)沉默是否能夠提高化療藥物DDP對A549細(xì)胞的作用效果。應(yīng)用Western blot法檢測RGC32基因沉默時磷酸化p38蛋白在A549細(xì)胞表達(dá)的改變，并應(yīng)用p38抑制劑SB203580抑制p-p38，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。
　　結(jié)果：
　　1、肺腺癌組織中RGC32 mRNA的表達(dá)
　　Real-time PCR檢測32例肺腺癌組織表達(dá)中的RGC32 mRNA表達(dá)。結(jié)果顯示，

5、與癌旁組織相比，肺腺癌組織中RGC32 mRNA表達(dá)明顯增加。
　　2、miR-656調(diào)控RGC32基因表達(dá)
　　應(yīng)用TargetScanHuman5.1等軟件，預(yù)測RGC32基因是miR-656的靶基因，在RGC32 mRNA-3'UTR有miR-656結(jié)合位點(diǎn)。Real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，肺腺癌組織中miR-656表達(dá)明顯增加。而且RGC32與miR-656的表達(dá)水平呈明顯負(fù)相關(guān)。miR-656前

6、體能夠顯著降低RGC32基因的表達(dá)。熒光素酶報告基因表達(dá)分析證實(shí)miR-656能夠與RGC32基因3'UTR結(jié)合，負(fù)性調(diào)控RGC32基因的表達(dá)。
　　3、RGC32基因表達(dá)沉默對A549細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響
　　Real-time PCR和Western blot檢測證實(shí)，siRNA-RGC32能夠顯著抑制A549細(xì)胞中RGC32基因的表達(dá)。而RGC32基因表達(dá)沉默能夠顯著地抑制A549細(xì)胞的增殖能力，促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡。

7、
　　4、RGC32基因表達(dá)沉默對A549細(xì)胞化療敏感性的影響
　　RGC32基因表達(dá)沉默能夠顯著地提高化療藥物DDP對A549細(xì)胞的作用效果，DDP處理后的RGC32基因表達(dá)沉默的A549細(xì)胞的增殖能力進(jìn)一步降低，凋亡率進(jìn)一步增加。
　　5、p38/MAPK通路在RGC32基因調(diào)控A549細(xì)胞凋亡中的作用。
　　Real-time PCR和Western blot檢測證實(shí)，RGC32基因表達(dá)沉默能夠顯著上調(diào)A5

8、49細(xì)胞中p-p38蛋白的表達(dá)。應(yīng)用p38抑制劑SB203580抑制A549細(xì)胞中上調(diào)的p-p38，A549細(xì)胞的凋亡率顯著降低。
　　結(jié)論：
　　1、RGC32基因在肺腺癌中表達(dá)顯著上調(diào)，miR-656在肺腺癌中表達(dá)顯著降低，RGC32與miR-656的表達(dá)水平呈顯著地負(fù)相關(guān)。
　　2、miR-656能夠通過與RGC32基因3'UTR特定序列靶向結(jié)合并負(fù)性調(diào)控RGC32基因的表達(dá)。
　　3、RGC32基因在肺腺