hPTTG基因轉(zhuǎn)染對肺腺癌A549細胞部分惡性表型的影響.pdf

1、背景： 腫瘤細胞的染色體數(shù)目畸變是腫瘤細胞的特征性改變之一。由于以往對姐妹染色單體分離機制認識有限，所以盡管人們很早就發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞的染色體數(shù)目異常，但對其發(fā)生機制一直缺乏深入研究。近年來，有關(guān)姐妹染色單體分離機制的研究有了較大進展。目前已知：姐妹染色單體分離由保全素(securing/PTTG)和分離酶(separase/ESP1)等相關(guān)蛋白控制，保全素能抑制分離酶的活性；在有絲分裂的后期，后期促進復合物(anaphase-pr

2、omotingcomplex，APC)降解保全素，導致分離酶活化、粘合素(cohesin/SCC1)水解，姐妹染色單體在著絲粒處發(fā)生分離，進而移向兩極，分配到兩個子代細胞中。 本室以往研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)分離酶基因ESP1的表達可以明顯降低腫瘤細胞染色體數(shù)目，抑制增殖和誘導凋亡。由于，PTTG基因(pituitarytumor-transforminggene)編碼的保全素是參與姐妹染色單體分離過程的重要調(diào)控蛋白之一，我們希望了解上調(diào)P

3、TTG(保全素)表達后將對腫瘤細胞的染色體數(shù)目、細胞周期、細胞增殖和凋亡的惡性表型產(chǎn)生怎樣的影響，這將有助于我們進一步認識PTTG與腫瘤細胞染色體分離障礙及PTTG與腫瘤細胞部分惡性表型之間的聯(lián)系。 目的： 觀察hPTTG基因上調(diào)表達對A549細胞染色體數(shù)目、細胞周期分布、細胞增殖和凋亡的影響，并且進一步探討了hPTTG基因促增殖效應的可能機制。 方法： (1)克隆hPTTG基因的編碼區(qū)片段；(2)構(gòu)建攜

4、帶hPTTG基因的真核表達載體；(3)脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染A549細胞并用G418篩選出其穩(wěn)定表達的陽性克隆株；(4)熒光定量PCR和免疫細胞化學染色檢測轉(zhuǎn)染后hPTTGmRNA及蛋白的表達水平；(5)人工計數(shù)法檢測A549細胞染色體數(shù)目的變化；(6)流式細胞術(shù)(flowcytometry，F(xiàn)CM)觀察細胞周期分布；(7)氚-胸腺嘧啶核苷(3H-tritiatedthymidine，3H-TdR)摻入法觀察hPTTG基因轉(zhuǎn)染后細胞增殖能力的改

5、變；(8)采用磷脂酰絲氨酸結(jié)合蛋白/碘化丙啶雙參數(shù)法(AnnexinV-fluoresceinisothiocyanate/povidone-iodine，AnnexinVFITC/PI法)觀察hPTTG基因轉(zhuǎn)染前后的細胞凋亡；(9)熒光定量PCR和免疫細胞化學染色觀察hPTTG基因轉(zhuǎn)染后A549細胞表達cyclinD1和cyclinE的情況。 結(jié)果： (1)克隆了hPTTG基因的編碼區(qū)片段；(2)成功構(gòu)建了攜帶hPTT

6、G基因的真核表達載體(命名為pdsRED-C1/hPTTG)；(3)獲得hPTTG基因上調(diào)表達的A549細胞株；(4)pdsRED-C1/hPTTG基因轉(zhuǎn)染使A549細胞hPTTGmRNA和蛋白的表達較未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒組均顯著增強；(5)hPTTG基因轉(zhuǎn)染后染色體眾數(shù)和平均數(shù)較對照組降低，肉眼觀察染色體形態(tài)愈加不規(guī)則；(6)hPTTG基因轉(zhuǎn)染后細胞增殖指數(shù)(proliferationindex，PI)和S期細胞分數(shù)(S-phase

7、cellfraction，SPF)均較對照空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組顯著升高；(7)hPTTG基因轉(zhuǎn)染后3H摻入量較對照組顯著升高；(8)hPTTG基因轉(zhuǎn)染后細胞凋亡率與對照組比較無顯著差異；(9)轉(zhuǎn)染hPTTG基因的A549細胞cyclinD1和cyclinE表達較對照組明顯升高。 結(jié)論：hPTTG基因上調(diào)表達對A549細胞最明顯的影響是顯著促進了細胞增殖，這種作用可能是通過上調(diào)細胞周期調(diào)控蛋白cyclinD1和cyclinE的表達水平的