hPTTG基因轉(zhuǎn)染對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞部分惡性表型的影響.pdf

1、背景： 腫瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目畸變是腫瘤細(xì)胞的特征性改變之一。由于以往對(duì)姐妹染色單體分離機(jī)制認(rèn)識(shí)有限，所以盡管人們很早就發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目異常，但對(duì)其發(fā)生機(jī)制一直缺乏深入研究。近年來(lái)，有關(guān)姐妹染色單體分離機(jī)制的研究有了較大進(jìn)展。目前已知：姐妹染色單體分離由保全素(securing/PTTG)和分離酶(separase/ESP1)等相關(guān)蛋白控制，保全素能抑制分離酶的活性；在有絲分裂的后期，后期促進(jìn)復(fù)合物(anaphase-pr

2、omotingcomplex，APC)降解保全素，導(dǎo)致分離酶活化、粘合素(cohesin/SCC1)水解，姐妹染色單體在著絲粒處發(fā)生分離，進(jìn)而移向兩極，分配到兩個(gè)子代細(xì)胞中。 本室以往研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)分離酶基因ESP1的表達(dá)可以明顯降低腫瘤細(xì)胞染色體數(shù)目，抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡。由于，PTTG基因(pituitarytumor-transforminggene)編碼的保全素是參與姐妹染色單體分離過(guò)程的重要調(diào)控蛋白之一，我們希望了解上調(diào)P

3、TTG(保全素)表達(dá)后將對(duì)腫瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目、細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖和凋亡的惡性表型產(chǎn)生怎樣的影響，這將有助于我們進(jìn)一步認(rèn)識(shí)PTTG與腫瘤細(xì)胞染色體分離障礙及PTTG與腫瘤細(xì)胞部分惡性表型之間的聯(lián)系。 目的： 觀察hPTTG基因上調(diào)表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞染色體數(shù)目、細(xì)胞周期分布、細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并且進(jìn)一步探討了hPTTG基因促增殖效應(yīng)的可能機(jī)制。 方法： (1)克隆hPTTG基因的編碼區(qū)片段；(2)構(gòu)建攜

4、帶hPTTG基因的真核表達(dá)載體；(3)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞并用G418篩選出其穩(wěn)定表達(dá)的陽(yáng)性克隆株；(4)熒光定量PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)轉(zhuǎn)染后hPTTGmRNA及蛋白的表達(dá)水平；(5)人工計(jì)數(shù)法檢測(cè)A549細(xì)胞染色體數(shù)目的變化；(6)流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry，F(xiàn)CM)觀察細(xì)胞周期分布；(7)氚-胸腺嘧啶核苷(3H-tritiatedthymidine，3H-TdR)摻入法觀察hPTTG基因轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖能力的改

5、變；(8)采用磷脂酰絲氨酸結(jié)合蛋白/碘化丙啶雙參數(shù)法(AnnexinV-fluoresceinisothiocyanate/povidone-iodine，AnnexinVFITC/PI法)觀察hPTTG基因轉(zhuǎn)染前后的細(xì)胞凋亡；(9)熒光定量PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察hPTTG基因轉(zhuǎn)染后A549細(xì)胞表達(dá)cyclinD1和cyclinE的情況。 結(jié)果： (1)克隆了hPTTG基因的編碼區(qū)片段；(2)成功構(gòu)建了攜帶hPTT

6、G基因的真核表達(dá)載體(命名為pdsRED-C1/hPTTG)；(3)獲得hPTTG基因上調(diào)表達(dá)的A549細(xì)胞株；(4)pdsRED-C1/hPTTG基因轉(zhuǎn)染使A549細(xì)胞hPTTGmRNA和蛋白的表達(dá)較未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒組均顯著增強(qiáng)；(5)hPTTG基因轉(zhuǎn)染后染色體眾數(shù)和平均數(shù)較對(duì)照組降低，肉眼觀察染色體形態(tài)愈加不規(guī)則；(6)hPTTG基因轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖指數(shù)(proliferationindex，PI)和S期細(xì)胞分?jǐn)?shù)(S-phase

7、cellfraction，SPF)均較對(duì)照空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組顯著升高；(7)hPTTG基因轉(zhuǎn)染后3H摻入量較對(duì)照組顯著升高；(8)hPTTG基因轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組比較無(wú)顯著差異；(9)轉(zhuǎn)染hPTTG基因的A549細(xì)胞cyclinD1和cyclinE表達(dá)較對(duì)照組明顯升高。 結(jié)論：hPTTG基因上調(diào)表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞最明顯的影響是顯著促進(jìn)了細(xì)胞增殖，這種作用可能是通過(guò)上調(diào)細(xì)胞周期調(diào)控蛋白cyclinD1和cyclinE的表達(dá)水平的