F10基因?qū)549細(xì)胞凋亡、化療敏感性及致瘤性的影響.pdf

1、研究背景和目的：
　　 F10基因是本課題組在已完成的國(guó)家973課題研究過(guò)程中，采用抑制性消減雜交的方法，從葡萄胎與正常早孕絨毛的差異cDNA文庫(kù)中篩選出的一條功能未知新基因(GenBank登錄號(hào)AB196290)。由于該基因在消減雜交過(guò)程中，是將其保存在96孔板第F10孔的位置，故以F10暫時(shí)命名該基因。前期的研究表明，F(xiàn)10基因在葡萄胎、侵蝕性葡萄胎、絨痛中均呈陽(yáng)性表達(dá)且依次增強(qiáng)，在卵巢腺癌、子宮內(nèi)膜痛等婦科腫瘤中亦呈陽(yáng)性表

2、達(dá)，但在正常子宮內(nèi)膜和宮頸上皮組織中呈陰性表達(dá)?？梢?jiàn)，F(xiàn)10基因可能是一種與葡萄胎的惡性變及婦科惡性腫瘤的發(fā)生有關(guān)的新基因。由于目前婦科惡性腫瘤仍是威脅廣大婦女健康的主要疾病，因此，F(xiàn)10基因作為一種與葡萄胎的惡性變及婦科腫瘤發(fā)生相關(guān)的新基因，其功能研究對(duì)于揭示此類腫痛的發(fā)病機(jī)制、指導(dǎo)臨床治療具有重要意義。
　　 目前最為常見(jiàn)的基因功能研究方法是基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)，而適宜的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)載體對(duì)于基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和持續(xù)穩(wěn)定過(guò)表達(dá)起著關(guān)鍵作用。增

3、強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)是一種優(yōu)化的突變型綠色熒光蛋白，在488nm激發(fā)波處，能形成鮮明的綠色熒光。在組織和細(xì)胞中，EGFP能耐受各種處理而保持其發(fā)光特性。
　　 本研究擬采用基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)，研究以下內(nèi)容：(1)以F10基因低表達(dá)的A549細(xì)胞為細(xì)胞模型，以pEGFP-N1作為真核表達(dá)載體，構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)F10基因的A549細(xì)胞系；(2)在此基礎(chǔ)上，探討F1

4、0基因過(guò)表達(dá)對(duì)肺癌A549細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制；(3)選取紫杉醇為化療藥物，研究F10基因過(guò)表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞化療藥物敏感性的影響；(4)將過(guò)表達(dá)F10基因的A549細(xì)胞接種裸鼠，觀察F10基因?qū)549細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)致瘤性的影響，并通過(guò)檢測(cè)與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的CASPASE-3、BAX和BCL-2的表達(dá)，進(jìn)一步探討F10基因影響A549細(xì)胞致瘤性的作用機(jī)制。
　　 本課題屬原始創(chuàng)新性研究，通過(guò)研究葡萄胎高表達(dá)的F10基因?qū)5

5、49細(xì)胞凋亡、化療敏感性及致瘤性的影響，期望在F10基因功能的研究中有所突破，為將來(lái)發(fā)展基于F10基因的婦科腫瘤防治新措施提供理論支持。
　　 第一章 穩(wěn)定過(guò)表達(dá)F10基因的A549細(xì)胞株的建立及鑒定
　　 F10基因是一種功能未知的新基因，在肺癌A549細(xì)胞中呈現(xiàn)低表達(dá)。pEGFP-N1載體含有EGFP，可在488nm激發(fā)波處，形成鮮明的綠色熒光，標(biāo)記基因的表達(dá)情況，并且具有復(fù)制力強(qiáng)、含高效強(qiáng)大啟動(dòng)子和多克隆位點(diǎn)、含可

6、供G418篩選的新霉素耐藥標(biāo)記的基因neo等特點(diǎn)，這些特殊結(jié)構(gòu)使得它作為一種真核表達(dá)載體，能夠使目的基因在靶細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定過(guò)表達(dá)。基于這種理論，我們采用基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)，以pEGFP-N1為載體，將外源性F10基因?qū)階549細(xì)胞，期望建立一種穩(wěn)定過(guò)表達(dá)F10基因的A549細(xì)胞株，為進(jìn)一步研究F10基因的生物學(xué)功能提供一個(gè)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。
　　 研究方法
　　 設(shè)計(jì)并構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-N1-F10和pEGFP-N1-Mock，經(jīng)

7、EcoR Ⅰ和Kpn Ⅰ雙酶切、DNA測(cè)序鑒定正確后，轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞株，經(jīng)G418篩選，獲得陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株。利用熒光定量PCR技術(shù)鑒定陽(yáng)性克隆。
　　 小結(jié)
　　 1.以pEGFP-N1為真核表達(dá)載體，設(shè)計(jì)并構(gòu)建出pEGFP-N1-F10重組質(zhì)粒，對(duì)pEGFP-N1-F10質(zhì)粒進(jìn)行酶切和測(cè)序，結(jié)果證實(shí)F10基因已成功連接至pEGFP-N1載體。
　　 2.以F10基因低表達(dá)的肺癌A549細(xì)胞為細(xì)胞模型，將pE

8、GFP-N1-F10質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，經(jīng)G418篩選，獲得陽(yáng)性單克隆細(xì)胞。利用熒光定量PCR鑒定陽(yáng)性克降，發(fā)現(xiàn)F10基因過(guò)表達(dá)組A549細(xì)胞中F10 mRNA的表達(dá)顯著高于陰性對(duì)照組A549細(xì)胞，提示穩(wěn)定過(guò)表達(dá)F10基因的A549細(xì)胞系成功構(gòu)建，這為進(jìn)一步研究F10基因的生物學(xué)功能提供了一個(gè)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。
　　 第二章 F10基因過(guò)表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞株凋亡的影響
　　 細(xì)胞凋亡受到多種基因調(diào)控，涉及多種酶的參與調(diào)節(jié)，其中

9、CASPASE-3和BAX是調(diào)控凋亡的兩個(gè)重要因子。而近年來(lái)的研究表明，腫瘤的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞凋亡受抑密切相關(guān)?；谶@些理論，我們利用已建立的穩(wěn)定過(guò)表達(dá)F10基因的A549細(xì)胞株，觀察F10基因過(guò)表達(dá)對(duì)肺癌A549細(xì)胞株凋亡的影響，并通過(guò)檢測(cè)與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的BAX和CASPASE-3的表達(dá)，探討F10基因影響A549細(xì)胞凋亡的機(jī)制。
　　 研究方法
　　 利用已建立的穩(wěn)定過(guò)表達(dá)F10基因的A549細(xì)胞株，并設(shè)F10+A

10、549細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，Mock-A549細(xì)胞為陰性對(duì)照組，A549-WT細(xì)胞為空白對(duì)照組。采用MTT檢測(cè)細(xì)胞體外增殖能力，TUNEL-FITC/Hoechst33258檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞BAX和CASPASE-3 mRNA表達(dá)，Western Blot檢測(cè)各組細(xì)胞BAX和CASPASE-3蛋白表達(dá)，并采用析因設(shè)計(jì)方差分析和單因素方差分析比較各組之間上述指標(biāo)的變化。
　　 小結(jié)
　　 1.利用MTT檢

11、測(cè)細(xì)胞體外增殖能力，發(fā)現(xiàn)從12h開(kāi)始，F(xiàn)10基因過(guò)表達(dá)組A549細(xì)胞較陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組生長(zhǎng)增快，提示F10基因促進(jìn)A549細(xì)胞增殖。同時(shí)，采用TUNEL-FITC/Hoechst33258染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組A549細(xì)胞中出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象的細(xì)胞均明顯較F10基因過(guò)表達(dá)組多，提示F10基因過(guò)表達(dá)抑制A549細(xì)胞凋亡。
　　 2.采用RT-PCR和Western Blot檢測(cè)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)F10基因過(guò)表達(dá)組A5

12、49細(xì)胞中BAX和CASPASE-3的mRNA和蛋白表達(dá)均低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，表明F10基因下調(diào)A549細(xì)胞中CASPASE-3和BAX表達(dá)，兩者參與了對(duì)凋亡的調(diào)控，提示F10基因過(guò)表達(dá)抑制A549細(xì)胞凋亡。
　　 第三章 F10基因過(guò)表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞株紫杉醇化療敏感性的影響
　　 化療是治療惡性腫瘤的重要方法，傳統(tǒng)的腫瘤治療觀念是化療藥物直接作用于核酸、微管蛋白及其它靶點(diǎn)以殺傷腫瘤細(xì)胞；現(xiàn)在認(rèn)識(shí)到化療藥物也可

13、以通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而殺傷腫瘤細(xì)胞。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)紫杉醇(TAXOL)即是通過(guò)凋亡機(jī)理發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，在治療肺痛等腫痛中被廣泛應(yīng)用。基于上述理論，我們以穩(wěn)定過(guò)表達(dá)F10基因的A549細(xì)胞株為平臺(tái)，選取紫杉醇為化療藥物，研究F10 基因過(guò)表達(dá)對(duì)化療藥物敏感性的影響，并通過(guò)檢測(cè)與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的CASPASE-3和BAX的表達(dá)，探討F10基因影響A549細(xì)胞化療敏感性的機(jī)制。
　　 研究方法
　　 利用已建立的穩(wěn)定過(guò)表達(dá)F10基

14、因的A549細(xì)胞株，并設(shè)F10+A549細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，Mock-A549細(xì)胞為陰性對(duì)照組，A549-WT細(xì)胞為空白對(duì)照組，分別給予紫杉醇處理。采用MTT檢測(cè)細(xì)胞體外增殖能力，TUNEL-FITC/Hoechst33258檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞BAX和CASPASE-3 mRNA表達(dá)，Western Blot檢測(cè)各組細(xì)胞BAX和CASPASE-3蛋白表達(dá)，并采用析因設(shè)計(jì)方差分析和單因素方差分析比較各組之間上述指標(biāo)的變化

15、。
　　 小結(jié)
　　 1.利用MTT和TUNEL-FITC/Hoechst33258染色檢測(cè)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)紫杉醇處理后，陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組A549細(xì)胞均較F10基因過(guò)表達(dá)組生長(zhǎng)持續(xù)減慢，凋亡細(xì)胞增多，提示F10基因過(guò)表達(dá)抑制A549細(xì)胞對(duì)紫杉醇化療的敏感性。
　　 2.采用RT-PCR和Western Blot檢測(cè)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)紫杉醇處理后，F(xiàn)10基因過(guò)表達(dá)組A549細(xì)胞中BAX和CASPASE-3的mRNA和蛋

16、白表達(dá)均低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，表明F10基因下調(diào)紫杉醇處理后的A549細(xì)胞中CASPASE-3和BAX表達(dá)，提示F10基因可下調(diào)A549細(xì)胞中CASPASE-3和BAX表達(dá)，進(jìn)而抑制其對(duì)紫杉醇的化療敏感性。
　　 第四章 F10 基因過(guò)表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞株致瘤性的影響
　　 自課題組發(fā)現(xiàn)F10基因以來(lái)，我們前期的工作主要集中于細(xì)胞水平上的研究，而裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)則可以模擬人體內(nèi)環(huán)境，在動(dòng)物活體上觀察F10基因?qū)δ[瘤細(xì)胞

17、致瘤性的影響。因此，我們將前期建立的穩(wěn)定過(guò)表達(dá)F10基因的肺癌A549細(xì)胞株接種裸鼠，觀察F10基因?qū)549細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)致瘤性的影響，并探討其機(jī)制。
　　 研究方法
　　 利用已構(gòu)建的過(guò)表達(dá)F10基因的A549細(xì)胞株，制備裸鼠肺癌動(dòng)物模型，致瘤小鼠隨機(jī)分為A549-WT、Mock-A549和F10+A549三組。通過(guò)裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)來(lái)確定F10基因?qū)Ψ伟〢549細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)致瘤性的影響，應(yīng)用免疫組化檢測(cè)成瘤組織中CAS

18、PASE-3、BAX和BCL-2的蛋白表達(dá)，并采用單因素方差分析和重復(fù)測(cè)量方差分析比較各組之間上述指標(biāo)的變化。
　　 小結(jié)
　　 將穩(wěn)定過(guò)表達(dá)F10基因的肺癌A549細(xì)胞株接種裸鼠，發(fā)現(xiàn)F10基因過(guò)表達(dá)組A549細(xì)胞接種后的腫瘤，其成瘤時(shí)間縮短、瘤體積增加，腫瘤生長(zhǎng)速度加快，免疫組化檢測(cè)顯示出相對(duì)于對(duì)照組較低的CASPASE-3和BAX表達(dá)水平以及較高的BCL－2表達(dá)水平。提示F10基因通過(guò)下調(diào)CASPASE-3和BAX