反義寡核苷酸抑制MMP7基因表達(dá)對肺腺癌A549細(xì)胞增殖、凋亡敏感性和侵襲能力影響的研究.pdf

1、背景與目的： 基質(zhì)溶解素(matrilysin，MMP7)是一種是一種鋅離子依賴性的蛋白水解酶<'[1]>，廣泛表達(dá)于包括肺腺癌在內(nèi)的多種腫瘤組織中。研究發(fā)現(xiàn)，MMP7可以降解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)和基底膜(basement membrane，BM)<'[2-3]>，在腫瘤細(xì)胞浸潤、遷移和轉(zhuǎn)移中起重要作用；MMP7還可以影響多種腫瘤細(xì)胞膜受體表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，抑

2、制凋亡<'[4-5]>。在發(fā)現(xiàn)MMP7高表達(dá)于非小細(xì)胞肺癌組織的前期工作基礎(chǔ)上，本研究通過反義基因技術(shù)體外抑制肺腺癌A549細(xì)胞MMP7的表達(dá)，檢測對A549細(xì)胞體外增殖、粘附、凋亡敏感性、侵襲能力的影響。 研究方法： ①設(shè)計和構(gòu)建針對MMP7 mRNA的采用硫代磷酸修飾的反義寡核苷酸(antisenseoligodeoxynucleotide，AS ODN)和錯義寡核苷酸(scrambled oligodeoxynuc

3、leotide，SCODN)通過脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞。 ②RT-PCR和免疫組化檢測MMP7 ASODN轉(zhuǎn)染對A549細(xì)胞MMP7 mRNA和蛋白表達(dá)的影響，以未轉(zhuǎn)染組和SCODN轉(zhuǎn)染組細(xì)胞為對照。 ③細(xì)胞增殖實驗觀察MMP7 ASODN對A549細(xì)胞體外增殖能力的影響。MTT比色法檢測A549-ASODN組(反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染)、A549-SCODN組(錯義寡核苷酸轉(zhuǎn)染)、．A549對照組(未轉(zhuǎn)染)光吸收值。倒置顯

4、微鏡、透射電鏡下觀察MMP7 ASODN轉(zhuǎn)染后A549細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。流式細(xì)胞儀觀察MMP7 ASODN對A549細(xì)胞周期的影響。 ④免疫組化和流式免疫熒光術(shù)檢測MMP7 ASODN對A549細(xì)胞Fas抗原表達(dá)的影響。采用人工合成的重組FasL誘導(dǎo)凋亡，流式細(xì)胞儀檢測A549-ASODN組與A549對照組、A549-SCODN組之間細(xì)胞凋亡率的差異。 ⑤體外細(xì)胞-基質(zhì)粘附實驗檢測MMP7 ASODN對A54

5、9細(xì)胞的粘附能力的影響?！甕ranswell侵襲實驗觀察A549-ASODN組和A5419對照組之間細(xì)胞侵襲能力的差異。 結(jié)果： ①RT-PCR結(jié)果顯示：和 A549-SCODN組、A549對照組相比，A549-ASODN組MMP7 mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.01)，免疫組化檢測結(jié)果顯示MMP7蛋白表達(dá)顯著下降。 ②MTT比色法檢測細(xì)胞增殖表明：不同濃度ASODN轉(zhuǎn)染組與SCODN對照組和A549對照組比較，

6、均能抑制A549細(xì)胞的增殖(P<0.05)，且對細(xì)胞生長抑制作用隨ASODN濃度的增加而增高。5 μmol/L的ASODN轉(zhuǎn)染組和7.5 μmol/L的ASODN轉(zhuǎn)染組抑制A549細(xì)胞的增殖狀況無顯著性差異(P>0.05)。抑制作用在48h最強(qiáng)。轉(zhuǎn)染ASODN后，相差顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)A549細(xì)胞體積變小，數(shù)目減少。電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞腫脹，透亮度增加，細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)變淡，胞漿內(nèi)可見空泡樣變，線粒體水腫，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)水腫。FCM檢測發(fā)現(xiàn)MMP7

7、ASODN可以抑制A549由G<,0>/G<,1>期進(jìn)入S期。 ③免疫組化和流式免疫熒光術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，MMP7 ASODN轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后，和A549對照組、A549-SCODN組相比，ASODN轉(zhuǎn)染組Fas抗原表達(dá)上調(diào)(P<0.01)。加入人工合成的重組FasL誘導(dǎo)凋亡，A549-ASODN組凋亡率明顯高于A549對照組和A549-SCODN組，組間比較有顯著性差異(P<0.01)。 ④體外細(xì)胞．基質(zhì)粘附實驗表明：A5

8、49-ASODN組粘附率明顯低于A549對照組，兩組間比較有顯著性差異(P<0.05)。體外細(xì)胞Transwell侵襲實驗發(fā)現(xiàn)：A549-ASODN組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯低于A549對照組，組間比較有顯著性差異(P<0.01)。 結(jié)論： ①硫代磷酸修飾的MMP7反義寡核苷酸能夠有效抑制A549細(xì)胞MMP7基因和蛋白的表達(dá)。②MMP7 ASODN能抑制A549細(xì)胞由G<,0>/G<,1>期進(jìn)入S期，引起細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變，抑制細(xì)胞