脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Cyclin D1反義寡核苷酸鏈對肺癌A549細(xì)胞影響的研究.pdf

1、肺癌是惡性程度和發(fā)病率均較高的腫瘤之一，腫瘤的發(fā)生是多因素、多階段、多步驟的復(fù)雜過程。分子生物學(xué)研究表明，肺癌的發(fā)生與癌基因激活、抑癌基因失活密切相關(guān)，這些基因改變的結(jié)果最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生長的無限制性。在細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化過程中，除癌基因、抑癌基因的正負(fù)調(diào)節(jié)失控外，細(xì)胞周期調(diào)控因子也是參與癌變過程的調(diào)節(jié)位點(diǎn)。CyclinD1基因是近年來提出的重要原癌基因，其基因蛋白產(chǎn)物在細(xì)胞周期關(guān)鍵限速點(diǎn)G1-S轉(zhuǎn)換中起重要正調(diào)控作用，使其成為一個有潛力

2、的腫瘤基因治療的理想靶點(diǎn)。 CyclinD1蛋白于1991年被發(fā)現(xiàn)并克隆出其相應(yīng)的cDNA，該蛋白在細(xì)胞周期關(guān)鍵限速卡點(diǎn)G1-S期轉(zhuǎn)移中通過激活cdk4和cdk6，使后者催化一系列關(guān)鍵底物(如Rb蛋白)磷酸化，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子釋放，促進(jìn)DNA合成而發(fā)揮加速細(xì)胞增殖的正性調(diào)節(jié)作用。CyclinD1是細(xì)胞增殖的正性調(diào)控因子，參與細(xì)胞的DNA合成、復(fù)制，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂，它的正常表達(dá)代表細(xì)胞正常的增殖活性。CyclinD1基因的過表達(dá)

3、，加速和維持細(xì)胞持續(xù)增殖，使細(xì)胞獲得永生化，成為具有無限增殖能力的腫瘤細(xì)胞。這對于細(xì)胞的惡變和腫瘤細(xì)胞的形成具有極為重要的意義，如果能夠特異性地抑制腫瘤細(xì)胞的CyclinD1活性或抑制其合成，就可以阻斷腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期，使其失去無限增殖能力，腫瘤停止生長，甚至自動消退而達(dá)到治療目的。 目前反義抑制CyclinD1的合成主要通過以下幾種途徑：1、利用核苷類似物抑制CyclinD1合成；2、利用反義技術(shù)抑制CyclinD1活性，包

4、括通過導(dǎo)入CyclinD1編碼基因的反義DNA序列及mRNA序列，抑制其轉(zhuǎn)錄與合成；3、利用分化誘導(dǎo)劑抑制CyclinD1活性；4、利用拮抗劑減少CyclinD1-CDK4復(fù)合物的生成，降低其活性。而通過克隆一段特定的反以cDNA序列(長度約20bp左右，通常為上游啟動序列或核心編碼序列)，干擾CyclinD1蛋白合成，從而導(dǎo)致基因沉默治療肺癌的方法，尚少見報道。 本研究選定人編碼CyclinD1的CCND1基因核心模板區(qū)域(C

5、DS)上游啟動子序列(181-200bp)作為作用靶位，以人工合成并標(biāo)記熒光蛋白的反義寡核苷酸鏈(ASON)抑制此靶區(qū)，用脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染法將其轉(zhuǎn)染肺腺癌A549細(xì)胞株，在倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染結(jié)果并進(jìn)行鑒定，觀察細(xì)胞生長情況，檢測不同時間和濃度下細(xì)胞增值特性，用MTT法檢測細(xì)胞存活率，流式細(xì)胞分析術(shù)檢測各細(xì)胞周期的比例，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用RT-PCR、WesternBlot、免疫組化等方法探討ASON作用后肺癌細(xì)胞周期基因P16的m

6、RNA和蛋白的變化。 綜上所述，本研究得出以下結(jié)論： 1.肺癌組織CyclinD1高表達(dá)，CyclinD1蛋白的過表達(dá)與NSCLC癌細(xì)胞分化程度及各型肺癌TNM分期不相關(guān)，提示CyclinD1蛋白過表達(dá)可能在肺癌發(fā)生的早期起一定作用；在肺癌組織中p27、P16與CyclinD1蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，三者在肺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起一定的作用。 2.ASON能成功轉(zhuǎn)染肺腺癌A549細(xì)胞，且在癌細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮抑制作用。