ATM對(duì)AT細(xì)胞輻射敏感性的影響及其作用機(jī)理的研究.pdf

1、目的：探討輻射介導(dǎo)的GM、ATM+．AT、AT細(xì)胞DNA損傷與修復(fù)；闡明毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)突變基因(Ataxiatel觚giectasiamutated，ATM)介導(dǎo)的乳癌基因1(breastcancergene1，Brcal)磷酸化及其下游DNA修復(fù)相關(guān)蛋白(DNAdamagerepairprotein51，RAD51)在脫氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid，DNA)損傷修復(fù)信號(hào)傳導(dǎo)通路中作用機(jī)理；探討60Coγ

2、射線照射前、后，BRCAl、RAD51蛋白在GM、ATM+．AT、AT細(xì)胞中的表達(dá)。 方法：(1)不同輻射劑量Y射線照射GM細(xì)胞、ATM+．AT細(xì)胞和AT細(xì)胞細(xì)胞；加入P13K抑制劑womnannin(WT)與對(duì)照組加入DMSO，應(yīng)用堿性彗星試驗(yàn)(alkalinecometassay)，也稱堿性單細(xì)胞凝膠電泳法，測(cè)定彗星率和彗星尾長(zhǎng)。(2)將60Coγ輻照后的AT細(xì)胞通過免疫共沉淀及WestemBlot法分析其中ATM和BRCA

3、1蛋白以及BRCAl和RAD51蛋白之間的相互作用。(3)應(yīng)用免疫熒光染色和激光掃描共聚焦顯微鏡，觀察GM、ATM+．AT、AT細(xì)胞在照射O和10Gy叫C0丫射線后，BRCAl、RAD51蛋白在上述細(xì)胞中的定位及表達(dá)并進(jìn)行定量分析。 結(jié)果：(1)三種細(xì)胞隨著輻射劑量的增大，彗星尾長(zhǎng)逐漸增加，各個(gè)劑量組之間比較有顯著差異(P＜0.001)；細(xì)胞之間比較：三種細(xì)胞尾長(zhǎng)按GM細(xì)胞、ATM+．AT細(xì)胞、AT細(xì)胞的順序逐漸增加，各個(gè)細(xì)胞組

4、之間比較有差異(P<0．05)；加入WT后細(xì)胞修復(fù)受到抑制，與對(duì)照組加入DMS0的尾長(zhǎng)比較有差異(P<0．05)，且各個(gè)細(xì)胞之間比較按GM細(xì)胞、ATM+．AT細(xì)胞、AT細(xì)胞的順序尾長(zhǎng)逐漸增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)。(2)GM細(xì)胞、ATM+．AT細(xì)胞BRCAl和RAD51蛋白均有表達(dá)，而AT細(xì)胞無表達(dá)。(3)未經(jīng)∞COY射線照射時(shí)，BRCAl、RAD51蛋白在GM、ATM+．AT、AT細(xì)胞中僅有少量表達(dá)并且無共定位表達(dá)，其中在AT

5、細(xì)胞中表達(dá)量最低；照射lOGy60Coγ射線后，BRCAl、RAD51在GM、ATM+．AT、AT細(xì)胞中表達(dá)量增高，其中GM、ATM+．AT細(xì)胞呈現(xiàn)共定位表達(dá)，AT細(xì)胞無共定位表達(dá)；GM、ATM+．AT細(xì)胞中BRCAl、RAD51蛋白表達(dá)量與AT細(xì)胞比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

6、大細(xì)胞損傷越明顯：而AT細(xì)胞對(duì)輻射的敏感性最強(qiáng)；WT對(duì)細(xì)胞損傷后的修復(fù)有抑制作用。(2)BRCAl由ATM介導(dǎo)磷酸化后可進(jìn)一步與RAD51相互作用，這是信號(hào)通路傳導(dǎo)過程中的一個(gè)級(jí)聯(lián)反映，從而修復(fù)損傷的DNA，保持基因組的穩(wěn)定性。(3)GM細(xì)胞和ATM+．AT細(xì)胞中存在ATM基因，ATM在射線等因素誘導(dǎo)下可以激活其下游基因BRCAl、RAD51，并且使這兩種蛋白表達(dá)或表達(dá)量增加并且相互作用，共同完成輻射損傷后的細(xì)胞修復(fù)；外源性ATM轉(zhuǎn)入正