RNAi體內(nèi)外特異性抑制食管癌細胞肝素酶基因表達的研究.pdf

1、食管癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，具有發(fā)病率高、發(fā)病隱匿、易轉(zhuǎn)移和死亡率高等特點。目前治療方法主要有手術(shù)、化療、放療等，對晚期食管癌患者不能手術(shù)治療，且放療、化療療效也不能令人滿意。所以尋求食管癌治療的新途徑為研究熱點之一。 RNA干擾(RNA interference，RNAi)是一種有效抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展和浸潤、轉(zhuǎn)移的新的基因治療方法。該方法是將雙鏈RNA(double strand RNA，dsRNA)導(dǎo)入細胞內(nèi)引起同源mR

2、NA降解的一種細胞反應(yīng)過程。dsRNA進入細胞后被特異性dsRNA核酸酶(Dicer)切割成多個21bp-25bp的短干擾RNA(short interfering RNAs，siRNAs)，siRNAs與一些核酸酶結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)，由RISC介導(dǎo)同源mRNA的降解，屬于轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptional gene silenci

3、ng，PTGS)的一種?？芍苯釉隗w外大量合成，易于篩選有效序列，為構(gòu)建RNAi重組載體奠定基礎(chǔ)。自從1998年被發(fā)現(xiàn)以來，作為有力工具，RNAi技術(shù)已被用于大腸癌、肝癌、卵巢癌等多種人類腫瘤的研究，但應(yīng)用其研究食管癌少見報道。 乙酰肝素酶，又名肝素酶(heparanase，HPA)是一種能夠降解硫酸乙酰肝素(haeparan sulfate,HS)的糖苷內(nèi)切酶,HS是糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)家族中的

4、一個成員，是一種線性多聚糖，幾條HS鏈與核心蛋白共價結(jié)合組成硫酸乙酰肝素糖蛋白(haeparan sulfate proteoglycans，HSPGs)，HSPGs是一類廣泛存在于細胞表面、細胞外基質(zhì)(ECM)和基底膜(BM)中的糖蛋白，它與多種生物活性分子結(jié)合并相互作用，HPA對HSPGs的降解，改變了組織的完整性，并釋放出生物活性分子，如堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblastgrowth factors,bFGF

5、)，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growthfactor,VEGF)等，從而產(chǎn)生一系列的生物學(xué)現(xiàn)象如妊娠、炎癥反應(yīng)、血管生成等，促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究應(yīng)用RNAi技術(shù)體內(nèi)外特異性抑制食管癌細胞HPA表達，并采用免疫組化、原位雜交等技術(shù)檢測RNAi抑制后HPA蛋白及mRNA在食管癌EC9706細胞、裸鼠食管癌抑制瘤組織中的表達情況，為臨床應(yīng)用RNAi技術(shù)對食管癌進行基因治療提供理論依據(jù)。 材料

6、和方法 1．食管癌EC9706細胞的培養(yǎng)：食管癌EC9706細胞以10﹪胎牛血清培養(yǎng)液(含青、鏈霉素各100<'u>/ml)在37℃、5﹪CO<,2>條件下貼壁培養(yǎng)。 2．dsRNA的體外合成和鑒定：首先合成DNA模板， 3’端為T7啟動子序列，可在體外和T7 RNA聚合酶結(jié)合轉(zhuǎn)錄出目的dsRNA。應(yīng)用4﹪瓊脂糖凝膠電泳，以定量模板DNA為參照，測定dsRNA的長度和濃度。 3．轉(zhuǎn)染：應(yīng)用L,ipofectami

7、ne<'TM> 2000脂質(zhì)體將dsRNA轉(zhuǎn)染各組EC9706細胞。 4．HPA RNAi體外抑制實驗：采用濃度為10μmol/L、 15μmol/L、20μmol/L體外合成的HPA siRNA轉(zhuǎn)染EC9706細胞24h、48h、72h，另設(shè)無關(guān)序列組及不轉(zhuǎn)染組作為對照。 5．HPA RNAi體內(nèi)抑制實驗：①先轉(zhuǎn)染后成瘤：采用濃度為20μmol/L體外合成的siRNA轉(zhuǎn)染EC9706細胞72h，另設(shè)無關(guān)序列組及不轉(zhuǎn)染組

8、。然后種植于裸鼠皮下構(gòu)建裸鼠食管癌移植瘤動物模型；②先成瘤后轉(zhuǎn)染：構(gòu)建裸鼠食管癌移植瘤模型，待腫瘤長出1W后，依3μg/只/次腹腔注射siRNA及無關(guān)序列，連續(xù)3d,另1組僅注射PBS作空白對照，6．轉(zhuǎn)染后檢測：采用免疫組化、原位雜交等方法檢測轉(zhuǎn)染后的EC9706細胞及裸鼠食管癌移植瘤中HPA蛋白及mRNA表達情況。 7．統(tǒng)計學(xué)處理：應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，資料用均數(shù)±標準差(X±S)表示；多組均數(shù)的比較用方

9、差分析，方差不齊時先進行變量轉(zhuǎn)換。顯著性水準a=0.05。結(jié)果1.成功體外合成兩條HPA siRNA，長度為21bp。 2．免疫細胞化學(xué)結(jié)果：10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L3種不同濃度特異HPAsiRNA轉(zhuǎn)染食管癌EC9706細胞24h、48h、72h后，HPA蛋白表達量均較對照組有所降低，以20μmol/L轉(zhuǎn)染72h的抑制效應(yīng)最為明顯，3種濃度兩兩相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，每個時間段內(nèi)隨劑

10、量增加siRNA抑制效應(yīng)均增強，3種濃度兩兩相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，無關(guān)序列對照組及不轉(zhuǎn)染組(空白對照組)均未表現(xiàn)出對。HPA蛋白表達的抑制效應(yīng)。各實驗組與無關(guān)序列對照組及空白對照組兩兩相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01=。 3.原位雜交結(jié)果： 10 μmol/L、 15μmol/L、20μmol/L三種不同濃度特異HPA siRNA轉(zhuǎn)染食管癌EC9706細胞24h、48h、72h后，HPAmRNA表達量均

11、較對照組有所降低，同樣以20 μmol/L轉(zhuǎn)染72h的抑制效應(yīng)最為明顯，3者兩兩相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，每個時間段內(nèi)隨劑量增加siRNA抑制效應(yīng)均增強，3者兩兩相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，無關(guān)序列組及不轉(zhuǎn)染組均未表現(xiàn)出對HPA mRNA表達的抑制效應(yīng)。各實驗組與無關(guān)序列對照組及空白對照組兩兩相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。 4.HPA siRNA體外轉(zhuǎn)染食管癌EC9706細胞24h、48

12、h、72h后，其對HPA蛋白表達的抑制效應(yīng)和對HPA mRNA表達的抑制效應(yīng)，呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。 5．裸鼠體內(nèi)實驗結(jié)果：①先轉(zhuǎn)染后成瘤組：濃度為20μmol/LHPA siRNA可下調(diào)裸鼠食管癌移植瘤組織中HPA蛋白及mRNA的表達，與無關(guān)序列組及空白對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；②先成瘤后轉(zhuǎn)染組：濃度為20μmol/L HPA siRNA亦可下調(diào)裸鼠食管癌移植瘤組織中HPA蛋白及mRNA的表達，與

13、無關(guān)序列組及PBS空白對照組相比，差異均有顯著性(P<0.05)。①中siRNA的抑制效應(yīng)較②稍弱，但兩者相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)6．無論是先轉(zhuǎn)染后成瘤組或是先成瘤后轉(zhuǎn)染組，HPA RNAi對裸鼠食管癌移植瘤組織中HPA蛋白和對其mRNA表達影響呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05，先轉(zhuǎn)染后成瘤組r=6．87；先成瘤后轉(zhuǎn)染組r=7．04)。 結(jié)論 1．應(yīng)用體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)可成功合成dsRNA。 2．體外采用不同

14、濃度的HPA siRNA轉(zhuǎn)染EC9706細胞后，EC9706細胞中HPA蛋白及mRNA表達均受到一定程度的抑制，同時HPAdsRNA可有效體內(nèi)抑制裸鼠食管癌移植瘤組織中HPA蛋白及mRNA表達，提示HPAsiRNA可通過特異性抑制HPA mRNA表達從而抑制HPA蛋白表達，進而抑制食管癌或其它惡性腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移。 3．先轉(zhuǎn)染后成瘤組及先成瘤后轉(zhuǎn)染組中，HPAsiRNA均對裸鼠食管癌移植瘤組織中HPA蛋白及mRNA表達有抑制作用，