RNAi特異性抑制食管癌細(xì)胞cathepsin B基因表達(dá)的研究.pdf

1、鄭州大學(xué)碩士學(xué)位論文RNAi特異性抑制食管癌細(xì)胞cathepsinB基因表達(dá)的研究姓名：婁欣申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：病理學(xué)與病理生理學(xué)指導(dǎo)教師：張紅陳奎生20070501鄭州大學(xué)2007屆碩士研究生論文RNAi特異性抑制食管癌細(xì)胞cathepsinB基因表達(dá)的研究食管癌等惡性腫瘤進(jìn)行基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。材料和方法1食管癌EC9706細(xì)胞的培養(yǎng)：食管癌EC9706細(xì)胞以含10％胎牛血清的培養(yǎng)液在37℃、5％C02條件下貼壁培養(yǎng)。2siR

2、NA的體外合成和鑒定：首先合成DNA模板，5’端為T7啟動(dòng)子序列，可在體外和T7RNA聚合酶結(jié)合轉(zhuǎn)錄出目的siRNA(2Int)。分別合成一段特異性siRNA和一段無(wú)關(guān)對(duì)照siRNA。應(yīng)用4％瓊脂糖凝膠電泳，測(cè)定siRNA的長(zhǎng)度和濃度。3轉(zhuǎn)染：應(yīng)用LipofectamineTM2000siRNATransfectionReagent將siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞。設(shè)24h、48h、72h三個(gè)轉(zhuǎn)染時(shí)間段，每個(gè)時(shí)間段均設(shè)100、150、200pmol

3、三個(gè)轉(zhuǎn)染劑量及正常、空白、無(wú)關(guān)三個(gè)對(duì)照。4轉(zhuǎn)染后檢測(cè)：應(yīng)用完整細(xì)胞原位雜交、免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)靶基因的表達(dá)情況，應(yīng)用Boydenchamber體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞體外侵襲力的變化。5統(tǒng)計(jì)方法：應(yīng)用SPSS100統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，資料以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差(一XS)表示，多樣本均數(shù)比較采用方差分析。a=005為顯著性標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果1成功體外合成兩段siRNA，長(zhǎng)度為21bp。2原位雜交結(jié)果：特異siRNA轉(zhuǎn)染24h、48h、72h，CBm

4、RNA表達(dá)量均較對(duì)照有所降低，以轉(zhuǎn)染72h的抑制效應(yīng)最為明顯，三者兩兩相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(尸O05)；每個(gè)時(shí)間段內(nèi)隨劑量增]／[IsiRNA抑制效應(yīng)均增強(qiáng)，三者兩兩相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(PO05)；正常對(duì)照、空白對(duì)照、無(wú)關(guān)對(duì)照均未表現(xiàn)出對(duì)CBmRNA表達(dá)的抑制效應(yīng)，實(shí)驗(yàn)組與3者兩兩相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(PO05)。3免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果：特異siRNA轉(zhuǎn)染24h、48h、72h，CB蛋白表達(dá)量均較對(duì)照有所降低，以轉(zhuǎn)染72h的抑