人溶菌酶基因乳腺特異性表達(dá)載體的構(gòu)建及其在小鼠乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、人溶菌酶(humanlysozyme，hLYZ)參與機(jī)體的防御機(jī)制，有抗感染、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)的作用，因此在醫(yī)學(xué)、食品工業(yè)等領(lǐng)域得到十分廣泛的應(yīng)用。天然hLYZ一般是從人乳、中性粒細(xì)胞或尿液中少量提取，但由于來源極其困難，提取方法復(fù)雜，且安全性得不到保障，不能進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器具有表達(dá)水平高、表達(dá)產(chǎn)物活性強(qiáng)、易于純化和無污染等優(yōu)點(diǎn)，是大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白的新途徑。 因此，本研究以奶牛β-酪蛋白基因調(diào)控

2、區(qū)為指導(dǎo)元件，以人溶菌酶(hLYZ)cDNA為表達(dá)序列，構(gòu)建了乳腺特異性表達(dá)載體pEBH。轉(zhuǎn)染小鼠乳腺癌細(xì)胞EMT6，篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)株，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析及Westernblot檢測(cè)。相關(guān)結(jié)果如下： 1.通過RT-PCR技術(shù)成功的從人胎盤組織中擴(kuò)增出長(zhǎng)度為853bp的hLYZ基因cDNA，包含完整的編碼序列。經(jīng)序列分析表明，片段與GenBank中登錄的人hLYZcDNA序列的同源性為99％。在讀碼框內(nèi)，只有

3、三個(gè)堿基發(fā)生點(diǎn)突變。但分析表明，這三處突變不影響蛋白質(zhì)功能。 2.利用定向克隆的方法，將hLYZ表達(dá)序列與改造好的初級(jí)乳腺表達(dá)載體pBCP融合在一起，然后定向克隆至真核表達(dá)載體pEGFP-C1中，最終構(gòu)建了含有抗性基因和綠色熒光蛋白(EGFP)報(bào)告基因的hLYZ非融合型乳腺特異性表達(dá)載體pEBH。 3.通過脂質(zhì)體法將表達(dá)載體pEBH轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的小鼠乳腺癌細(xì)胞EMT6，經(jīng)G418抗性篩選，得到的陽性細(xì)胞可穩(wěn)定地表達(dá)綠