REGgamma基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其在人乳腺癌細(xì)胞中的功能研究.pdf

1、第一部分REGγ基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的建立。 目的：構(gòu)建REGgamma（RECγ）基因的真核表達(dá)重組體pcDNA3.1-REGγ，并建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染REGγ基因的乳腺（癌）細(xì)胞株，為進(jìn)一步深入研究REGγ基因的功能奠定基礎(chǔ)。 方法：提取MCF-7細(xì)胞的總RNA為模板，通過(guò)RT-PCR獲取全長(zhǎng)REGγ cDNA，經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、EcoRⅤ酶切后與pcDNA3.1連接構(gòu)建重組體。以Lipofect

2、amine2000將重組體導(dǎo)入HBL-100、MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞，由G418篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。并經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)、細(xì)胞免疫熒光、Western Blot、RT-PCR等方法檢測(cè)各株細(xì)胞的REGγ表達(dá)。 結(jié)果：經(jīng)內(nèi)切酶酶切及DNA序列分析證實(shí)重組體構(gòu)建成功。經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)、細(xì)胞免疫熒光、Western Blot、RT-PCR等檢測(cè)證實(shí)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中其REGγ的表達(dá)與未轉(zhuǎn)染的同種細(xì)胞相比均明顯增強(qiáng)，有顯著性差異

3、（P<0.01）；REGγ在乳腺癌細(xì)胞株的表達(dá)明顯高于乳腺上皮細(xì)胞株（P<0.05）；在兩株乳腺癌細(xì)胞株中，MDA-MB-231表達(dá)的REGγ高于MCF-7（P<0.05）。 結(jié)論：真核表達(dá)重組體pcDNA3.1-REGγ構(gòu)建成功，并經(jīng)抗生素篩選獲得了穩(wěn)定高表達(dá)REGγ的細(xì)胞株，為進(jìn)一步研究REGγ的功能奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細(xì)胞株中REGγ的表達(dá)明顯高于乳腺上皮細(xì)胞株；在乳腺癌細(xì)胞株中，惡性潛能高的細(xì)胞株REGγ的表達(dá)高

4、于惡性潛能低的細(xì)胞株。第二部分REGγ基因在人乳腺癌細(xì)胞中的功能研究。 目的：探討REGγ基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞增殖、凋亡及其對(duì)癌基因的影響。 方法：通過(guò)軟瓊脂集落形成試驗(yàn)、采用噻唑藍(lán)（MTT）比色法、流式細(xì)胞儀（FCM）檢測(cè)REGγ對(duì)細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響；免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)增殖細(xì)胞核抗原（proliferative cell nuclear antigen，PCNA）、bcl-2、fas、c-myc的表達(dá)；分光光度法檢測(cè)

5、Caspase-3活性變化；AnnexinⅤ-FITC的FCM檢測(cè)來(lái)了解細(xì)胞凋亡的變化；以透射電子顯微鏡（TEM）觀察轉(zhuǎn)染REGγ引起的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變；Western Blot檢測(cè)REGγ對(duì)其靶蛋白p21和SRC-3及癌基因CyclinD1的影響。 結(jié)果：MTT法及FCM檢測(cè)提示，增加REGγ表達(dá)可使細(xì)胞生長(zhǎng)加速、細(xì)胞倍增時(shí)間縮短、S+G2+M的增殖期細(xì)胞數(shù)明顯增加。軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)染REGγ基因的細(xì)胞集落形成率高、

6、克隆形成時(shí)間短、克隆存活時(shí)間長(zhǎng)。PCNA的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染RECγ基因的細(xì)胞PCNA表達(dá)明顯增強(qiáng)（p<0.01）。Caspase-3分光光度法檢測(cè)顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的OD值普遍低于對(duì)照組（p<0.05）；AnnexinⅤ-FITC的FCM檢測(cè)顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的凋亡率明顯低于對(duì)照組（p<0.01）；免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染REGγ基因的細(xì)胞表達(dá)bcl-2增強(qiáng)（p<0.05）、表達(dá)fas減弱（p<0.05）、表達(dá)c-myc增強(qiáng)

7、（p<0.05）；TEM觀察轉(zhuǎn)染REGγ基因的細(xì)胞表現(xiàn)為核仁肥大，線粒體、高爾基體豐富或擴(kuò)張，未見(jiàn)凋亡小體形成；Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染REGγ基因的細(xì)胞，其p21和SRC-3表達(dá)減弱（p<0.05）、但癌基因CyclinD1表達(dá)增強(qiáng)（p<0.01）。 結(jié)論：REGγ基因能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及增殖，抑制乳腺癌細(xì)胞凋亡。其機(jī)制可能與REGγ基因參與了細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡基因的調(diào)控有關(guān)。 第三部分轉(zhuǎn)染REGγ基因

8、對(duì)乳腺癌細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響。 目的：研究REGγ基因轉(zhuǎn)染乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞后在裸鼠體內(nèi)的成瘤作用及其機(jī)制。 方法：以穩(wěn)定高表達(dá)REGγ基因的細(xì)胞株為實(shí)驗(yàn)組、轉(zhuǎn)染空載體及未施加處理因素的細(xì)胞為對(duì)照組。將此3組細(xì)胞接種于裸鼠皮下，觀察移植瘤的生長(zhǎng)狀況并計(jì)算抑瘤率；RT-PCR檢測(cè)REGγ基因在瘤組織中的表達(dá)；FCM檢測(cè)瘤組織的腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（TIL）中CD16的表達(dá)及腫瘤細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡；免疫組化檢測(cè)移

9、植瘤中p21的表達(dá)。 結(jié)果：與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組移植瘤生長(zhǎng)速度較快、體積較大、瘤重增加（P<0.05）；RT-PCR檢測(cè)顯示REGγ基因在瘤組織中的表達(dá)增加（P<0.01）；FCM檢測(cè)提示CD16陽(yáng)性率明顯降低，G0/G1和G2/M期細(xì)胞減少，S期細(xì)胞明顯增多，腫瘤細(xì)胞的凋亡率明顯降低（P<0.05）；P21的表達(dá)明顯降低（P<0.05）。 結(jié)論：REGγ基因在體內(nèi)具有促進(jìn)乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的作用，其機(jī)制可能與其具有加速細(xì)