syk基因真核表達載體的構(gòu)建及其對乳腺癌細胞侵襲性抑制作用的體外研究.pdf

1、目的：腫瘤是嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病，其中乳腺癌是女性發(fā)病率最高的一種惡性腫瘤，并呈逐年上升趨勢，嚴(yán)重威脅著廣大婦女的身心健康。乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展是一個復(fù)雜、多步驟的過程，與許多基因和蛋白質(zhì)的表達密切相關(guān)，包括原癌基因的激活 (如HER2/neu)、抑癌基因的突變和丟失(如p53)等。幾十年來，對乳腺癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中的基因改變和功能分析一直是該領(lǐng)域研究的焦點。蛋白酪氨酸激酶(PTKs)是一組能催化底物蛋白酪氨酸殘基磷酸化的酶蛋

2、白，參與許多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在控制細胞分化、增殖和擴散中起重要作用。Syk是一種非受體型蛋白酪氨酸激酶，表達于正常乳腺腺體和上皮組織，可以促進乳腺上皮細胞生長。近來發(fā)現(xiàn)，Syk是乳腺癌細胞生長和轉(zhuǎn)移中重要的抑制因子，在非侵襲性乳腺癌細胞表達降低，而在侵襲性乳腺癌細胞中則表達明顯降低或缺失。Syk表達降低或缺失與正常乳腺組織向惡性發(fā)展有關(guān)，但是，Syk抑制腫瘤細胞侵襲性生長的具體機制尚不清楚。本研究將 syk 基因克隆到真核表達載體pcDN

3、A3.1D/V5-His-TOPO中，在脂質(zhì)體作用下轉(zhuǎn)染Syk表達缺失的MDA-MB-231細胞，檢測該基因誘導(dǎo)的細胞功能改變，為進一步探討Syk抑制腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移的具體機制奠定基礎(chǔ)。 方法：1 構(gòu)建 syk 基因的真核表達載體提取人乳腺癌細胞MDA-MB-468總RNA，RT-PCR擴增syk編碼序列基因片段，并將其克隆到真核表達載體 pcDNA3.1D/V5-His-TOPO中。經(jīng)PCR擴增、Apa Ⅰ酶切及DNA測序鑒定

4、，證實pcDNA3.1D/V5-His-TOPO/syk真核表達載體構(gòu)建成功。 2 轉(zhuǎn)染人乳腺癌細胞以脂質(zhì)體介導(dǎo)法將 pcDNA3.1D/V5-His-TOPO/syk 真核表達載體轉(zhuǎn)染Syk缺失的人乳腺癌細胞MDA-MB-231，經(jīng)G418篩選，構(gòu)建syk基因穩(wěn)定表達的細胞株MDA-MB-231/syk，通過Western blot和RT-PCR技術(shù)，驗證Syk在轉(zhuǎn)染后的乳腺癌細胞中的表達情況。 3 VEGF和MMP

5、-9的表達分析用流式細胞術(shù)和半定量RT-PCR技術(shù)檢測3組細胞：轉(zhuǎn)染syk cDNA組細胞(MDA-MB-231/syk)、轉(zhuǎn)染空載體組細胞 (MDA-MB-231/pcDNA3.1)和未轉(zhuǎn)染組野生型細胞 (MDA-MB-231)中VEGF和MMP-9的表達情況。 4 細胞增殖實驗 MTT 法檢測 MDA-MB-231/syk、MDA-MB-231/pcDNA3.1和MDA-MB-231細胞的生長增殖能力，繪制生長曲線。

6、 5 細胞遷移和侵襲能力檢測用體外遷移和侵襲力實驗測定MDA-MB-231/syk、MDA-MB-231/pcDNA3.1 和 MDA-MB-231細胞的遷移和侵襲能力。 結(jié)果：1成功構(gòu)建了pcDNA3.1D/V5-His-TOPO/syk真核表達載體。 2 MDA-MB-231/syk細胞穩(wěn)定表達Syk蛋白。 3 MDA-MB-231/syk細胞較 MDA-MB-231/pcDNA3.1 和MDA-MB-231