Cystatin M和Cathepsin B單-雙基因共表達(dá)載體轉(zhuǎn)染對(duì)乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移抑制作用的體外研究.pdf

1、目的：通過對(duì)人Cystatin M(CST6)和反義Cathepsin B(CB)基因克隆和表達(dá)，觀察CST6和反義CB單/雙基因表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞體外增殖、黏附、遷移及侵襲能力的影響，為進(jìn)一步探討CST6和反義CB抗乳腺癌作用機(jī)制提供理論依據(jù)。 方法：PCR一步法擴(kuò)增CB目的片段，基因克隆技術(shù)構(gòu)建pBudCE4.1-CB及pBudCE4.1-CB-CST6重組載體。PCR、酶切、測(cè)序方法篩選陽性重組質(zhì)粒。脂質(zhì)體法將單基因重組質(zhì)粒

2、和CST6及反義CB雙基因共表達(dá)載體導(dǎo)入具有高侵襲性、高轉(zhuǎn)移性的人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231；Western-blot方法鑒定CST6和CB蛋白表達(dá)；噻唑蘭比色(MTT)法和免疫組化Ki-67檢測(cè)CST6和反義CB表達(dá)對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力的影響；體外黏附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其表達(dá)對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞與基質(zhì)(Matrigel)、纖維連接素(Fibronectin)黏附能力的影響；Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)觀察轉(zhuǎn)染后腫瘤細(xì)

3、胞遷移和侵襲能力的變化。 結(jié)果： 1.應(yīng)用基因克隆技術(shù)建立pBudCE4.1/CB重組載體和CST6及反義CB雙基因共表達(dá)載體pBudCE4.1-CB-CST6，并瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231。 2.體外增殖實(shí)驗(yàn)顯示：?jiǎn)位蜣D(zhuǎn)染組MDA/CB和MDA/CST6細(xì)胞的增殖能力與空載體組、未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞相比明顯下降(P<0.01)；同時(shí)雙基因轉(zhuǎn)染組MDA/CB-CST6細(xì)胞的增殖能力較MDA/CB和MDN

4、CST6細(xì)胞更進(jìn)一步受到顯著抑制(P<0.01)。 3.在黏附實(shí)驗(yàn)、Transwell侵襲運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)中，與未轉(zhuǎn)染組、空載體對(duì)照組相比，單基因轉(zhuǎn)染組MDA/CB和MDA/CST6細(xì)胞與基質(zhì)的黏附能力、體外侵襲能力和遷移能力均顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；運(yùn)用pBudCE4.1-CB-CST6雙基因共表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染后，腫瘤細(xì)胞的基質(zhì)黏附能力、遷移能力及體外侵襲能力均受到顯著抑制，且抑制較單基因轉(zhuǎn)染組MDA/CB和MD