DEDD抑制乳腺癌生長、侵襲和轉(zhuǎn)移.pdf

1、腫瘤轉(zhuǎn)移是最主要的實體腫瘤致死原因。轉(zhuǎn)移是一個多環(huán)節(jié)的過程：腫瘤細胞對其周圍組織侵襲；穿過血管/淋巴管壁進入循環(huán)系統(tǒng)；通過循環(huán)到達遠端并在此穿出管壁在遠端組織形成轉(zhuǎn)移灶；轉(zhuǎn)移灶生長最終形成轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)。目前對于轉(zhuǎn)移的詳細機制尚不完全清楚。死亡受體結(jié)構(gòu)域(Deatheffectordomains，DEDs)是蛋白發(fā)生相互作用的區(qū)域，含有DED的蛋白可以介導(dǎo)由死亡受體觸發(fā)的程序性細胞死亡或凋亡。DED本身沒有酶活性而是作為其他DEDs的結(jié)合區(qū)域

2、，因而促進蛋白復(fù)合體形成。FADD、caspase8以及DEDD均屬于含有DED結(jié)構(gòu)域的蛋白。研究表明，DEDD通過活化caspase3或capase6在CD95介導(dǎo)的凋亡途徑中發(fā)揮重要作用。近來發(fā)現(xiàn)DEDD也參與細胞周期調(diào)控并抑制有絲分裂進程。我們最近研究發(fā)現(xiàn)DEDD與核因子smad3相互作用，抑制后者的生物學功能。然而，DEDD在腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移中的具體作用尚不清楚。
　　 目的：
　　 以乳腺癌為研究對象，研究

3、DEDD在腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中所發(fā)揮的生物學作用，并闡明DEDD在腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用機制。
　　 方法：
　　 免疫組化檢測人乳腺癌和結(jié)腸癌病理標本中DEDD的表達水平；Westernblot檢測不同惡性程度人乳腺癌細胞株中DEDD的表達水平；構(gòu)建pcDNA3.1-DEDD表達質(zhì)粒，構(gòu)建pSliencer-DEDDshRNA干擾質(zhì)粒；在低轉(zhuǎn)移的MCF7細胞株中轉(zhuǎn)染pSliencer-DEDDshRNA，潮

4、霉素篩選穩(wěn)定表達DEDD-shRNA的干擾細胞株，在高轉(zhuǎn)移的MDA-MA-231細胞株中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-DEDD，G418篩選穩(wěn)定表達DEDD的過表達細胞株；transwell檢測細胞的遷移和侵襲能力；Westernblot和confocal檢測EMT相關(guān)指標E-cadherin，β-catenin，Vimentin，a-SMA變化情況。Westernblot檢測EMT調(diào)節(jié)因子Snail，Twist等的變化，蛋白降解實驗檢測Sna

5、il，Twist降解等。
　　 結(jié)果：
　　 本研究發(fā)現(xiàn)，在人乳腺癌和結(jié)腸癌病理標本中，DEDD表達水平與腫瘤的不良預(yù)后呈負相關(guān)。檢測不同惡性程度的人乳腺癌細胞株，及其他組織腫瘤細胞株中DEDD的表達水平發(fā)現(xiàn)，DEDD與腫瘤細胞株的惡性程度呈負相關(guān)。體外和體內(nèi)實驗結(jié)果表明，干擾MCF7細胞株中DEDD的表達之后，其生長、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移能力大大增加；相應(yīng)的在MDA-MB-231中過表達DEDD之后，可以顯著抑制其生長、遷

6、移、侵襲和轉(zhuǎn)移能力。干擾DEDD之后，可誘導(dǎo)MCF7細胞發(fā)生上皮間葉轉(zhuǎn)化(EMT)，下調(diào)上皮樣標志E-cadherin和β-catenin的表達，同時上調(diào)間葉樣標志Vimentin和α-SMA的表達；相應(yīng)的在穩(wěn)定表達DEDD的MDA-MB-231中，其上皮間葉轉(zhuǎn)化(EMT)進程發(fā)生逆轉(zhuǎn)，E-cadherin和β-catenin的表達上調(diào)，而Vimentin和a-SMA則顯著下調(diào)。干擾DEDD可誘導(dǎo)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail，Twist

7、和Slug的表達，而過表達DEDD使得上述轉(zhuǎn)錄因子表達降低。通過報告基因檢測和蛋白降解實驗發(fā)現(xiàn)，DEDD對Snail，Twist的調(diào)節(jié)主要發(fā)生在降解水平。免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)Snail與LC3存在共定位，說明其可通過自噬途徑進行降解，抑制自噬可抑制Snail的降解。免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)DEDD可以與自噬調(diào)節(jié)因子PI3KⅢ/Beclin1復(fù)合物相互作用，并維持后者的穩(wěn)定性，進而維持自噬的活性。最后在干擾DEDD的MCF7細胞中過表達PI3KⅢ/