血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子D在乳腺癌轉(zhuǎn)移和侵襲中作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分 VEGF-D/VEGFR-3在人乳腺良、惡性病變中的表達(dá)
　　1、目的：檢測(cè)VEGF-D/VEGFR-3在乳腺良、惡性組織中的表達(dá)，并進(jìn)行淋巴管計(jì)數(shù)。
　　2、材料和方法：
　　乳腺癌標(biāo)本40例、良性病變80例，real-time qPCR技術(shù)檢測(cè)乳腺組織中VEGF-D/VEGFR-3mRNA水平的表達(dá)，免疫組化方法檢測(cè)VEGF-D/VEGFR-3在蛋白水平的表達(dá)并計(jì)數(shù)D2-40標(biāo)記的陽(yáng)性染色淋巴管數(shù)量（LV

2、D）。
　　3、結(jié)果：
　　以real-time qPCR方法檢測(cè)VEGF-D mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在乳腺癌組織、乳腺良性組織中存在明顯差異，其在乳腺癌組織中表達(dá)量明顯高于乳腺良性組織(P<0.05)；VEGFR-3 mRNA在乳腺癌組織中表達(dá)量明顯高于乳腺良性組織，存在明顯差異(P<0.05)。
　　用免疫組化方法檢測(cè)VEGF-D/VEGFR-3蛋白水平的表達(dá)情況，結(jié)果顯示二者在乳腺癌組織中均呈不同程度的高表達(dá)，陽(yáng)性

3、染色計(jì)數(shù)顯著高于良性組織中，差異顯著(P<0.05)；同時(shí)計(jì)數(shù)了D2-40標(biāo)記的陽(yáng)性淋巴管密度（LVD），亦在惡性組織中有更高的表達(dá)。
　　4、結(jié)論：
　　real-time qPCR技術(shù)和免疫組織化學(xué)技術(shù)用于乳腺組織中VEGF-D/ VEGFR-3的檢測(cè)是可行的。
　　乳腺癌中VEGF-D/VEGFR-3的表達(dá)以及淋巴管密度（LVD）顯著高于良性乳腺組織，在mRNA和蛋白水平的差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　VEGF

4、-D及其受體可能可以作為研究乳腺癌轉(zhuǎn)移和侵襲能力的參考指標(biāo)。
　　第二部分人乳腺癌中VECF-D/VEGFR-3表達(dá)的臨床意義
　　1、目的：
　　結(jié)合乳腺癌臨床病理特征分析VECF-D/VEGFR-3異常表達(dá)的臨床意義和研究?jī)r(jià)值。
　　2、材料和方法：
　　選用同一批樣本，收集每位患者的手術(shù)史、腫瘤大小、病理分級(jí)、分型、合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、是否有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和其他相關(guān)腫瘤指標(biāo)包括，雌激素受體（ER）、孕激素受

5、體（PR）、人表皮生長(zhǎng)因子受體-2(Her2)，采用統(tǒng)一的免疫組化染色評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，分析乳腺癌中VECF-D/VEGFR-3表達(dá)的臨床意義。
　　3、結(jié)果
　　40例樣本中，VEGF-D32例陽(yáng)性表達(dá)，瘤內(nèi)高表達(dá)28例（70％），而在腫瘤周邊表達(dá)相對(duì)弱，高表達(dá)為9例（22.5%），標(biāo)本不同部位的高表達(dá)的例數(shù)相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；VEGFR-3可見陽(yáng)性細(xì)胞的有37例（92.5%），瘤內(nèi)呈高表達(dá)者19例（47.5%），瘤

6、周高表達(dá)者22例（55%），標(biāo)本中不同部位高表達(dá)的例數(shù)沒有顯著區(qū)別(P>0.05)；D2-40標(biāo)記陽(yáng)性例數(shù)為40例（100%），不論染色強(qiáng)弱，以陽(yáng)性淋巴管密度（LVD）作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，瘤周顯著高于腫瘤實(shí)質(zhì)內(nèi)(P<0.05)。
　　VEGF-D在瘤內(nèi)的高表達(dá)與VEGFR-3密切相關(guān)，而瘤周的表達(dá)與VEGFR-3無(wú)關(guān)。VEGF-D的表達(dá)水平和乳癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤的病理分級(jí)、Her2的表達(dá)和LVD數(shù)值密切相關(guān)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0

7、5)，與患者年齡、月經(jīng)狀態(tài)、腫瘤大小、ER、PR、一年期無(wú)進(jìn)展無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。
　　VEGFR-3的表達(dá)水平和患者淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P<0.05），和患者的其他臨床因素沒有顯著相關(guān)性（P>0.05）。
　　LVD計(jì)數(shù)在瘤周顯著高于瘤內(nèi)（P<0.05），與病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P<0.05），與其他因素?zé)o相關(guān)性（P>0.05）。
　　4、結(jié)論
　　乳腺癌中VEGF-D和LVD的表達(dá)存在位置特異性，

8、前者瘤內(nèi)表達(dá)強(qiáng)，后者瘤周表達(dá)強(qiáng)于瘤內(nèi)，并且與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理級(jí)別和Her2表達(dá)有關(guān)；VEGFR-3的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，三者均是研究乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的有價(jià)值的指標(biāo)。
　　第三部分靶向VEGF-D的shRNA構(gòu)建及其對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231生長(zhǎng)和侵襲的影響
　　1、目的：
　　構(gòu)建靶向VEGF-D的shRNA，在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證其穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)染效率和生物學(xué)功能。
　　2、材料和方法：
　　按照shR

9、NA序列設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)并合成3條針對(duì)VEGF-D基因的shRNA，挑選最有效抑制 VEGF-D基因表達(dá)的一條干擾序列，轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231，Western-blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染特異shRNA后乳腺癌細(xì)胞VEGF-D和VEGFR-3的蛋白表達(dá)情況，計(jì)數(shù)細(xì)胞存活比率，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖。
　　3、結(jié)果：
　　成功構(gòu)建了正確的靶向VEGF-D的shRNA，其中一條干擾RNA降低 VEGF-D的mRNA和蛋白表達(dá)的能力最強(qiáng)

10、，命名為shRNA1，同時(shí)建立對(duì)照組。檢測(cè)細(xì)胞計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)干擾組和對(duì)照組沒有顯著差別（P>0.05），MTT法檢測(cè)細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)未受明顯影響（P>0.05）；VEGFR-3蛋白的表達(dá)明顯下降（P<0.05），Transwell小室實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)干擾組穿過人工基質(zhì)的能力明顯下降（P<0.05）。
　　4、結(jié)論：
　　靶向VEGF-D的shRNA能顯著降低VEGF-D和VEGFR-3的表達(dá)，并能抑制腫瘤細(xì)胞在體外的侵襲能力，應(yīng)該是一

11、種有效的下調(diào)腫瘤細(xì)胞侵襲能力的策略。
　　第四部分VEGF-D shRNA抑制乳腺癌的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究
　　1、目的：
　　以VEGF-D shRNA處理乳腺癌荷瘤鼠模型，觀察腫瘤生長(zhǎng)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生存的的變化，通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)分析該干擾策略的潛在應(yīng)用價(jià)值。
　　2、材料和方法：
　　建立乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的荷瘤小鼠模型，以前面實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建的VEGF-D shRNA干擾小鼠種植瘤的生長(zhǎng)，并建立對(duì)照組。觀察各組

12、小鼠腫瘤的體積、重量，小鼠的生存時(shí)間、VEGF-D、VEGFR-3表達(dá)和LVD計(jì)數(shù)的差異。
　　3、結(jié)果：
　　RNA干擾組小鼠腫瘤生長(zhǎng)減慢，觀察終止時(shí)重量、體積均明顯小于對(duì)照組（P<0.05），表現(xiàn)出明顯的抑瘤率（P<0.05），生存時(shí)間明顯改善（P<0.05）；血清中VEGFR-3的含量沒有發(fā)現(xiàn)明顯的差異（P>0.05）；LVD計(jì)數(shù)在RNA干擾組有明顯的減少（P<0.05）。
　　4、結(jié)論：
　　以靶向VEG