血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在肝臟組織工程中的作用.pdf

1、肝臟組織工程研究始于二十世紀(jì)九十年代，它旨在構(gòu)建可植入性肝臟，從而緩解肝臟器官來源的緊缺，是解決肝疾病的最佳途徑和方式。同其他組織工程一樣，肝臟組織工程研究主要集中在以下幾個(gè)方面：種子細(xì)胞，如骨髓源干細(xì)胞，肝卵圓細(xì)胞，原代肝細(xì)胞，胚胎肝細(xì)胞，肝細(xì)胞株等；支架材料，包括天然基質(zhì)材料和合成高分子聚合物；生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子，它們可促進(jìn)細(xì)胞增殖，組織或血管的修復(fù)和再生；以及血管化問題等。其中血管重建是肝臟組織工程的重點(diǎn)和難點(diǎn)之一，大量研究表明，

2、原代肝細(xì)胞很難在體外大量增殖與傳代，同時(shí)肝細(xì)胞聚集體內(nèi)部細(xì)胞容易死亡，此類狀況均與缺乏微血管及膽管系統(tǒng)有關(guān)。在肝再生過程中，由肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞分泌的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial
　　 growth factor VEGF）是參與肝臟組織結(jié)構(gòu)重建和血管形成的重要生長(zhǎng)因子，實(shí)驗(yàn)中通過檢測(cè)VEGF在大鼠肝再生過程中的經(jīng)時(shí)變化，探討VEGF在肝再生中的重要作用。
　　 肝臟組織工程中生長(zhǎng)因子的應(yīng)用主要是在

3、培養(yǎng)體系中直接加入，另外也有文獻(xiàn)報(bào)道將生長(zhǎng)因子與材料結(jié)合以固定化生長(zhǎng)因子的形式使用。但由于生長(zhǎng)因子半衰期短，這為研究工作增加了成本。隨著基因工程學(xué)和材料學(xué)的不斷融合發(fā)展，設(shè)計(jì)開發(fā)VEGF質(zhì)?；蜓b載支架，實(shí)現(xiàn)在支架上培養(yǎng)細(xì)胞的同時(shí)完成基因轉(zhuǎn)染，使細(xì)胞持續(xù)自主地表達(dá)目的基因的研究工作具有很大的發(fā)展?jié)摿?。?shí)驗(yàn)中利用了陽離子多聚物聚乙烯亞胺（PEI），它可濃縮DNA形成納米級(jí)顆粒，作為基因釋放載體轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞。通過考察PEI的細(xì)胞毒性，為進(jìn)一

4、步進(jìn)行基因裝載支架的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：wistar雄性大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、假手術(shù)組和實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組大鼠被切除70％的肝臟，分別于術(shù)后不同時(shí)段取出肝臟。用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)肝組織中VEGF的表達(dá)變化，增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）的變化，以及肝竇形成情況。同時(shí)選用分子量為25000，分枝狀的聚乙烯亞胺結(jié)合質(zhì)?；騪-MSCV-VEGF165，通過MTT法和凝膠電泳阻滯實(shí)驗(yàn)考察PEI的細(xì)胞毒性以及PEI和DNA的最佳

5、結(jié)合比例。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：正常肝組織中VEGF幾乎無表達(dá)；肝切除術(shù)（PH）后48小時(shí)VEGF表達(dá)量顯著增加，主要分布于門管區(qū)周圍；術(shù)后72小時(shí)VEGF的表達(dá)量達(dá)到高峰，幾乎遍及整個(gè)肝小葉；之后VEGF的表達(dá)量逐漸減少至正常水平。增殖細(xì)胞核抗原PCNA是反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的一個(gè)重要指標(biāo)，它定位于細(xì)胞核。免疫組化結(jié)果顯示，大鼠70％肝切除術(shù)后48小時(shí)肝細(xì)胞增殖數(shù)量達(dá)到高峰，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞稍慢于肝細(xì)胞的增殖，72小時(shí)增殖達(dá)到頂峰。肝切除

6、術(shù)后的一周內(nèi)，竇狀隙的大小逐步變化，肝竇經(jīng)歷了降解和重建的過程。同時(shí)，分子量為25000的聚乙烯亞胺PEI是一種毒性較低的基因轉(zhuǎn)染載體，體外二維肝原代細(xì)胞培養(yǎng)體系中PEI最大使用濃度約為40μg/ml，PEI和DNA最佳結(jié)合比例約為3/1。
　　 通過實(shí)驗(yàn)了解了肝再生過程中大部分VEGF由肝細(xì)胞分泌，肝細(xì)胞增殖可增強(qiáng)VEGF的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的分裂增殖，成為誘導(dǎo)肝臟微結(jié)構(gòu)構(gòu)建的主要因素之一，顯示出VEGF在肝再生過程中具有