頭花千金藤堿對乳腺癌的抑制作用及逆轉(zhuǎn)乳腺癌內(nèi)分泌耐藥的研究.pdf

1、研究目的:
　　乳腺癌已經(jīng)成為威脅女性身體健康的常見惡性腫瘤之一。近些年來，在全世界范圍內(nèi)，乳腺癌在導(dǎo)致女性死亡的惡性腫瘤中已經(jīng)躍居第二位。我國的流行病與統(tǒng)計學(xué)研究顯示，乳腺癌的發(fā)病率與死亡率正在逐年增長。在2015年，我國大約有4，000，000女性被診斷為乳腺癌，約2，000，000女性因乳腺癌而死亡。乳腺癌的綜合性治療方案包括外科手術(shù)治療，化學(xué)治療，放射治療，內(nèi)分泌治療，靶向藥物治療以及其他輔助性治療。中醫(yī)藥作為乳腺癌輔助性

2、治療中的重要方案，已經(jīng)受到越來越多的重視。頭花千金藤堿是一種具有抗癌作用的中藥，前期研究發(fā)現(xiàn)該藥物具有多種對抗腫瘤的功效。但其在乳腺癌中的抗腫瘤作用機制并不明確。本文通過應(yīng)用分子生物學(xué)基礎(chǔ)技術(shù)研究，探討中藥頭花千金藤堿在乳腺癌中的作用機制，為乳腺癌患者尋求新的治療方案提供重要的理論依據(jù)。
　　研究方法及結(jié)果
　　在本課題中，我們對頭花千金藤堿在乳腺癌中的作用機制進行了詳細的研究，具體研究內(nèi)容包括以下兩部分:
　　第一部

3、分頭花千金藤堿誘導(dǎo)乳腺癌細胞發(fā)生自噬、凋亡和細胞周期阻滯
　　研究方法:為了檢測頭花千金藤堿對乳腺癌細胞的抑制作用，我們使用MTT，平板克隆形成，體外劃痕實驗，侵襲和遷移實驗來進行驗證。我們進行了進一步的研究來詳細了解頭花千金藤堿抑制乳腺癌細胞增殖的具體作用機制。為了檢測其對乳腺癌細胞凋亡和細胞周期G0/G1期阻滯的影響，我們使用流式細胞檢測術(shù)及蛋白質(zhì)免疫印跡實驗進行驗證;通過吖啶橙熒光染色，MTT及流式細胞檢測技術(shù)檢測其對乳腺癌

4、細胞自噬的影響;接著，我們通過載體構(gòu)建以及蛋白質(zhì)免疫印跡實驗驗證頭花千金藤堿作用后AKT/mTOR信號通路的變化。
　　研究結(jié)果: MTT，平板克隆實驗結(jié)果顯示頭花千金藤堿能夠顯著抑制乳腺癌MCF-7及MDA-MB-231細胞的增殖;體外劃痕，侵襲和遷移實驗結(jié)果驗證了頭花千金藤堿能夠明顯抑制乳腺癌細胞的運動性;流式細胞檢測術(shù)及蛋白質(zhì)免疫印跡實驗檢測顯示頭花千金藤堿能夠誘導(dǎo)乳腺癌細胞發(fā)生凋亡細胞周期G0/G1期阻滯;通過吖啶橙染色，

5、流式細胞檢測術(shù)，蛋白質(zhì)免疫印跡實驗及MTT實驗檢測顯示頭花千金藤堿能夠誘導(dǎo)乳腺癌細胞發(fā)生自噬;接下來，我們在體外對乳腺癌細胞進行轉(zhuǎn)染，構(gòu)建AKT（pCDNA3.1-AKT）過表達細胞，再利用流式細胞檢測術(shù)和蛋白質(zhì)免疫印跡實驗，檢測結(jié)果顯示頭花千金藤堿通過調(diào)控AKT/mTOR信號通路進而對乳腺癌細胞發(fā)揮抑制作用。
　　第二部分頭花千金藤堿逆轉(zhuǎn)乳腺癌內(nèi)分泌耐藥的機制研究
　　研究方法:經(jīng)過1年時間的研究及培育，我們團隊在體外使用

6、他莫昔芬(10μM)誘導(dǎo)培養(yǎng)出MCF-7耐他莫昔芬的耐藥細胞株（M7-TR）。通過MTT實驗驗證他莫昔芬耐藥細胞系(M7-TR)及親代MCF-7對他莫昔芬的敏感性;利用Transwell實驗檢測M7-TR的侵襲和遷移能力;通過qRT-PCR及蛋白質(zhì)免疫印記實驗檢測M7-TR細胞中EMT相關(guān)標記物的改變。接著，我們使用MTT檢測頭花千金藤堿對M7-TR耐藥株的抑制作用;體外劃痕及Transwell實驗被用來檢測頭花千金藤堿對M7-TR耐藥

7、株侵襲和遷移能力的抑制作用;接著，通過qRT-PCR及蛋白質(zhì)免疫印記實驗檢測頭花千金藤堿作用于M7-TR細胞后EMT相關(guān)標記物的改變;接下來，我們在M7-TR細胞中進行了P65-siRNA轉(zhuǎn)染，再通過MTT，蛋白質(zhì)免疫印記實驗及Transwell實驗檢測頭花千金藤堿作用后M7-TR細胞中NF-κB信號通路及遷移能力的改變。
　　研究結(jié)果:MTT檢測結(jié)果顯示，相較于親代MCF-7細胞，M7-TR細胞對他莫昔芬的敏感性降低;Trans

8、well實驗顯示M7-TR的侵襲和遷移能力增強;同時，細胞形態(tài)學(xué)改變，qRT-PCR及蛋白質(zhì)免疫印記實驗檢測均提示M7-TR細胞發(fā)生了明顯的EMT樣改變;MTT實驗檢測結(jié)果顯示頭花千金藤堿對M7-TR有顯著的抑制作用;體外劃痕，Transwell實驗顯示頭花千金藤堿對M7-TR細胞的侵襲和遷移能力明顯抑制;qRT-PCR及蛋白質(zhì)免疫印記實驗顯示頭花千金藤堿能逆轉(zhuǎn)M7-TR細胞EMT改變;通過對M7-TR細胞進行P65-siRNA轉(zhuǎn)染，通

9、過MTT，蛋白質(zhì)免疫印記實驗及Transwell實驗顯示頭花千金藤堿通過調(diào)控NF-κB通路抑制M7-TR細胞的侵襲和遷移。
　　結(jié)論:
　　1.頭花千金藤堿可以誘導(dǎo)乳腺癌細胞發(fā)生凋亡、自噬及細胞周期G0/G1期阻滯;
　　2.頭花千金藤堿通過調(diào)控AKT/mTOR信號通路，進而對乳腺癌細胞發(fā)揮抑制作用;
　　3.頭花千金藤堿通過抑制乳腺癌內(nèi)分泌耐藥細胞發(fā)生EMT，進而對乳腺癌內(nèi)分泌耐藥引起的浸潤轉(zhuǎn)移發(fā)揮抑制作用;<