白藜蘆醇對乳腺癌細(xì)胞的增殖抑制和抗侵襲作用研究.pdf

1、目的：
　　 近年來我國乳腺癌(breast cancer)發(fā)病率逐年上升，成為威脅女性健康的主要惡性腫瘤。隨著醫(yī)療水甲的升高，雖然乳腺癌的生存期延長，但是乳腺癌治療之后的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)成為治療乳腺癌的難題。
　　 乳腺細(xì)胞表達(dá)多種激素受體，如雌激素受體(estrogen receptor, ER)、孕激素受體(progesterone receptor, PR)、泌乳素受體、雄激素受體等。乳腺細(xì)胞生長受多種激素的調(diào)控，雌激

2、素是影響乳腺癌發(fā)展的主要激素。當(dāng)乳腺癌細(xì)胞保留全部或大部分受體時，其生長受激素調(diào)節(jié)明顯，稱為激素依賴型乳腺癌;當(dāng)乳腺癌細(xì)胞只保留極少受體或受體缺失時，其生長不受激素影響，稱為激素非依賴型乳腺癌。雌激素受體陽性乳腺癌在激素治療后，常會出現(xiàn)雌激素抵抗，這是目前治療雌激素受體陽性型乳腺癌難以解決的問題。
　　 白藜蘆醇(Resveratrol，Res)是一種從植物中提取的天然多酚類化合物，具有多方面的生物學(xué)作用，實驗已經(jīng)證實的主要作用

3、包括保護心腦血管、降低血脂、減少女性骨質(zhì)疏松、抗腫瘤等。白藜蘆醇的抗腫瘤作用近幾年越來越受到人們的關(guān)注。實驗證明白藜蘆醇可以在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的多個階段抑制腫瘤，包括腫瘤細(xì)胞周期、增殖、遷移等。同時白藜蘆醇的化學(xué)結(jié)構(gòu)與人工合成雌激素己烯雌酚極為相似，具有雌激素樣作用。已有實驗證實在雌激素含量高低不同的小鼠體內(nèi)，白藜蘆醇可以發(fā)揮截然不同的雌激素作用或抗雌激素樣作用。
　　 本研究主要探討白藜蘆醇對雌激素受體表達(dá)不同的乳腺癌細(xì)胞的抑制

4、作用，包括對乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響，探討白藜蘆醇用于治療乳腺癌的機制和可能性。
　　 方法和結(jié)果：
　　 1.白藜蘆醇對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響
　　 1.1 MTT法檢測白藜蘆醇對乳腺癌細(xì)胞DU4475、MDA-MB-231、MCF-7增殖的影響
　　 DU4475、MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞分別接種于96孔板中，每個處理組三復(fù)孔，用終濃度不同的白藜蘆醇作用細(xì)胞24h、48h、72h，用

5、MTT法檢測細(xì)胞的增殖狀況。結(jié)果顯示，隨著藥物濃度增加和作用時間延長，細(xì)胞的存活率明顯下降。Res對DU4475、MDA-MB-231細(xì)胞的抑制率較MCF-7細(xì)胞高。
　　 1.2流式細(xì)胞術(shù)檢測白藜蘆醇對DU4475、MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞周期的影響
　　 細(xì)胞經(jīng)12.5μ mol/L、25μ mol/L、50μ mol/L白藜蘆醇作用48小時后，用PI標(biāo)記DNA，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期。三種細(xì)胞的細(xì)胞周期

6、均有明顯改變:與對照組相比，各濃度均使細(xì)胞在S期發(fā)生阻滯。在三種濃度白藜蘆醇作用下，ER陽性的MCF-7細(xì)胞阻滯于S期的比例較ER陰性的兩種細(xì)胞低。
　　 ICI182，780對MDA-MB-231周期沒有影響，也不能干擾Res對細(xì)胞的周期作用;ICI182，780使MCF-7細(xì)胞堆積在G0/G1期，但這種作用在ICI182，780與Res合用時被干擾，合用使MCF-7細(xì)胞在S期發(fā)生阻滯。
　　 1.3流式細(xì)胞術(shù)檢測白藜

7、蘆醇對DU4475、MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞凋亡的影響
　　 12.5μ mol/L、25μ mol/L、50μ mol/L白藜蘆醇作用于DU4475、MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞48小時，用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。隨Res濃度升高兩種細(xì)胞的活細(xì)胞比例均減少，凋亡細(xì)胞數(shù)逐漸增高。DU4475加藥組的凋亡率最高可達(dá)37.41％，MDA-MB-231加藥組的凋亡率最高可達(dá)39.69％，MCF-7加藥組的凋亡率最

8、高僅為21.81％。當(dāng)Res濃度為50μ mol/L時，DU4475、MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡率高于MCF-7細(xì)胞。
　　 2.白藜蘆醇對乳腺癌細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白AKT、caspase-3的影響
　　 將MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞用終濃度為0、12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L白藜蘆醇培養(yǎng)48h，收集細(xì)胞，提取蛋白，用western blot檢測AKT磷酸化、caspase-3活化的情

9、況。實驗結(jié)果表明，隨著藥物濃度升高，細(xì)胞的p-AKT表達(dá)量均逐漸降低，caspase-3活化均增多，cleaved-caspase-3表達(dá)增加。
　　 3.白藜蘆醇對MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞遷移的影響和對MDA-MB-231侵襲的影響
　　 3.1細(xì)胞劃痕實驗檢測白藜蘆醇對MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞遷移能力的影響
　　 細(xì)胞經(jīng)過12.5μmol/L、50μmol/L、75μmol/L的白藜蘆

10、醇作用24h，細(xì)胞運動遷移能力下降。與對照組比較，加藥組細(xì)胞遷移被抑制，劃痕間隙比對照組大，并且藥物濃度越大劃痕間隙越大。
　　 3.2 Transwell法檢測白藜蘆醇對MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞遷移的影響
　　 用Transwell小室法檢測不同濃度Res對乳腺癌細(xì)胞遷移能力的影響。結(jié)果表明，作用48h細(xì)胞的遷移率較對照組降低，MDA-MB-231、MCF-7穿過微孔膜的細(xì)胞數(shù)減少。并且隨藥物濃度增加，細(xì)胞

11、遷移率逐漸降低。Res作用下，MDA-MB-231細(xì)胞遷移率低于MCF-7細(xì)胞。
　　 3.3 Transwell法檢測白藜蘆醇對MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力的影響
　　 在transwell小室上層鋪上基質(zhì)膠，檢測25μmol/L Res作用48h對MDA-MB-231細(xì)胞侵襲的影響。加藥組MDA-MB-231細(xì)胞穿過基質(zhì)膠粘附于下層膜的細(xì)胞數(shù)較對照組減少。
　　 3.4 RT-PCR檢測白藜蘆醇作用后MD

12、A-MB-231、MCF-7細(xì)胞MMP-2、MMP-9的表達(dá)
　　 12.5μmol/L、50μmol/L的白藜蘆醇作用MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞48h小時，收集細(xì)胞提取細(xì)胞總mRNA，用RT-PCR檢測MMP-2、MMP-9的mRNA表達(dá)量的改變，結(jié)果顯示兩種細(xì)胞MMP-2、MMP-9的mRNA表達(dá)量均減少，且隨濃度升高而降低。
　　 結(jié)論：
　　 本研究探討了白藜蘆醇作為一種抗腫瘤藥物，抑制乳腺癌增