自噬抑制綠膿桿菌制劑PA-MSHA抗乳腺癌細(xì)胞增殖作用的研究.pdf

1、目的：
　　 檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、自噬在綠膿桿菌制劑(PA-MSHA，Pseudomonas aeruginosa-mannose sensitive hemagglutinin)抗人乳腺癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡過(guò)程中的作用，并深入探討其機(jī)制，以更深入全面的了解PA-MSHA對(duì)人乳腺癌細(xì)胞的作用機(jī)制和耐藥機(jī)制。
　　 方法：
　　 第一部分
　　 1、透射電子顯微鏡觀察PA-MSHA作用后細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)形態(tài)的變化。<

2、br>　　 2、Western blot法檢測(cè)PA-MSHA作用后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白水平的變化。
　　 3、熒光顯微鏡觀察PA-MSHA作用后乳腺癌細(xì)胞內(nèi)綠色熒光斑點(diǎn)形態(tài)的變化情況。
　　 4、Western blot法檢測(cè)PA-MSHA作用后自噬相關(guān)蛋白水平的變化。
　　 第二部分
　　 1、光學(xué)顯微鏡觀察PA-MSHA、自噬抑制劑3-MA作用后乳腺癌細(xì)胞形態(tài)變化。
　　 2、Annexin

3、V-FITC和PI染色流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法、WST法、western blot檢測(cè)3-MA對(duì)PA-MSHA誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響。
　　 3、設(shè)計(jì)并合成針對(duì)人IRE1基因的shRNA片段，將shIRE1片段轉(zhuǎn)入乳腺癌細(xì)胞中，Westernblot法驗(yàn)證shRNA下調(diào)IRE1表達(dá)的有效性。
　　 4、觀察IRE1下調(diào)后PA-MSHA對(duì)自噬水平以及細(xì)胞增殖水平的影響。主要采用Annexin V-FITC和PI染色流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法

4、、Hoechst33258染色、western blot等方法檢測(cè)IRE1對(duì)于PA-MSHA引起的抗增殖、細(xì)胞凋亡等的影響。
　　 第三部分
　　 1、裸鼠乳房脂肪墊(mammary fat pad，MFP)接種人乳腺癌細(xì)胞，建立裸小鼠乳腺原位移植瘤模型。
　　 2、通過(guò)原位腫瘤大小、生長(zhǎng)情況、TUNEL試驗(yàn)和western blot等探討PA-MSHA及自噬抑制劑3-MA對(duì)裸鼠原位腫瘤生長(zhǎng)的影響。
　　

5、 結(jié)果：
　　 第一部分
　　 1、乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231HM細(xì)胞體外培養(yǎng)，經(jīng)PA-MSHA處理后，乳腺癌細(xì)胞內(nèi)部呈現(xiàn)出大量擴(kuò)張的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志性分子GRP78/Bip和CHOP經(jīng)western blot檢測(cè)表達(dá)升高，且呈劑量和時(shí)間依賴性。
　　 2、乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231HM細(xì)胞體外培養(yǎng)，經(jīng)PA-MSHA處理后，乳腺癌細(xì)胞內(nèi)部自噬泡數(shù)量增多；轉(zhuǎn)染GFP-LC3的細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)典型

6、的綠色熒光斑點(diǎn)；自噬的標(biāo)志性分子LC3和ATG5經(jīng)western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)量升高，且呈劑量和時(shí)間依賴性。
　　 第二部分
　　 1、MDA-MB-231、MDA-MB-231HM和MDA-MB-468細(xì)胞分別經(jīng)PA-MSHA，3-MA，PA-MSHA聯(lián)合3-MA處理48小時(shí)后，光鏡下觀察到PA-MSHA聯(lián)合3-MA處理組的細(xì)胞表現(xiàn)為皺縮、凋亡的細(xì)胞形態(tài)。Annexin V-FITC和PI染色流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法、W

7、ST法、western blot檢測(cè)均提示PA-MSHA聯(lián)合3-MA處理組中細(xì)胞凋亡的比例高于單純PA-MSHA或者3-MA處理組。
　　 2、skIRE1下調(diào)乳腺癌細(xì)胞IRE1基因后，MDA-MB-231、MDA-MB-231HM經(jīng)PA-MSHA處理，采用Armexin V-FITC和PI染色流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法、Hoechst33258染色、western blot等方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)skIRE1組自噬水平下降，凋亡比例增加。
　

8、　 第三部分
　　 PA-MSHA可以顯著抑制小鼠移植瘤生長(zhǎng)速度并縮小腫瘤體積大小，skIRE1具有提高PA-MSHA減緩移植瘤生長(zhǎng)速度的作用。TUNEL試驗(yàn)、western blot也提示shiRE1聯(lián)合PA-MSHA可以增加移植瘤中凋亡細(xì)胞的數(shù)量和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 PA-MSHA在抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)的同時(shí)，可以引起細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬。PA-MSHA能通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中IRE1通路