自噬抑制綠膿桿菌制劑PA-MSHA抗乳腺癌細胞增殖作用的研究.pdf

1、目的：
　　 檢測內質網(wǎng)應激、自噬在綠膿桿菌制劑(PA-MSHA，Pseudomonas aeruginosa-mannose sensitive hemagglutinin)抗人乳腺癌細胞增殖、誘導凋亡過程中的作用，并深入探討其機制，以更深入全面的了解PA-MSHA對人乳腺癌細胞的作用機制和耐藥機制。
　　 方法：
　　 第一部分
　　 1、透射電子顯微鏡觀察PA-MSHA作用后細胞亞結構形態(tài)的變化。<

2、br>　　 2、Western blot法檢測PA-MSHA作用后內質網(wǎng)應激相關蛋白水平的變化。
　　 3、熒光顯微鏡觀察PA-MSHA作用后乳腺癌細胞內綠色熒光斑點形態(tài)的變化情況。
　　 4、Western blot法檢測PA-MSHA作用后自噬相關蛋白水平的變化。
　　 第二部分
　　 1、光學顯微鏡觀察PA-MSHA、自噬抑制劑3-MA作用后乳腺癌細胞形態(tài)變化。
　　 2、Annexin

3、V-FITC和PI染色流式細胞計數(shù)法、WST法、western blot檢測3-MA對PA-MSHA誘導人乳腺癌細胞凋亡的影響。
　　 3、設計并合成針對人IRE1基因的shRNA片段，將shIRE1片段轉入乳腺癌細胞中，Westernblot法驗證shRNA下調IRE1表達的有效性。
　　 4、觀察IRE1下調后PA-MSHA對自噬水平以及細胞增殖水平的影響。主要采用Annexin V-FITC和PI染色流式細胞計數(shù)法

4、、Hoechst33258染色、western blot等方法檢測IRE1對于PA-MSHA引起的抗增殖、細胞凋亡等的影響。
　　 第三部分
　　 1、裸鼠乳房脂肪墊(mammary fat pad，MFP)接種人乳腺癌細胞，建立裸小鼠乳腺原位移植瘤模型。
　　 2、通過原位腫瘤大小、生長情況、TUNEL試驗和western blot等探討PA-MSHA及自噬抑制劑3-MA對裸鼠原位腫瘤生長的影響。
　　

5、 結果：
　　 第一部分
　　 1、乳腺癌細胞株MDA-MB-231HM細胞體外培養(yǎng)，經PA-MSHA處理后，乳腺癌細胞內部呈現(xiàn)出大量擴張的內質網(wǎng)腔，內質網(wǎng)應激的標志性分子GRP78/Bip和CHOP經western blot檢測表達升高，且呈劑量和時間依賴性。
　　 2、乳腺癌細胞株MDA-MB-231HM細胞體外培養(yǎng)，經PA-MSHA處理后，乳腺癌細胞內部自噬泡數(shù)量增多；轉染GFP-LC3的細胞胞漿內出現(xiàn)典型

6、的綠色熒光斑點；自噬的標志性分子LC3和ATG5經western blot檢測蛋白表達量升高，且呈劑量和時間依賴性。
　　 第二部分
　　 1、MDA-MB-231、MDA-MB-231HM和MDA-MB-468細胞分別經PA-MSHA，3-MA，PA-MSHA聯(lián)合3-MA處理48小時后，光鏡下觀察到PA-MSHA聯(lián)合3-MA處理組的細胞表現(xiàn)為皺縮、凋亡的細胞形態(tài)。Annexin V-FITC和PI染色流式細胞計數(shù)法、W

7、ST法、western blot檢測均提示PA-MSHA聯(lián)合3-MA處理組中細胞凋亡的比例高于單純PA-MSHA或者3-MA處理組。
　　 2、skIRE1下調乳腺癌細胞IRE1基因后，MDA-MB-231、MDA-MB-231HM經PA-MSHA處理，采用Armexin V-FITC和PI染色流式細胞計數(shù)法、Hoechst33258染色、western blot等方法檢測發(fā)現(xiàn)skIRE1組自噬水平下降，凋亡比例增加。
　

8、　 第三部分
　　 PA-MSHA可以顯著抑制小鼠移植瘤生長速度并縮小腫瘤體積大小，skIRE1具有提高PA-MSHA減緩移植瘤生長速度的作用。TUNEL試驗、western blot也提示shiRE1聯(lián)合PA-MSHA可以增加移植瘤中凋亡細胞的數(shù)量和凋亡相關蛋白的表達。
　　 結論：
　　 PA-MSHA在抑制乳腺癌細胞的生長的同時，可以引起細胞的內質網(wǎng)應激和自噬。PA-MSHA能通過內質網(wǎng)應激中IRE1通路