甘露糖敏感型綠膿桿菌制劑對肝癌細(xì)胞周期的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的:肝癌是世界上最常見、惡性程度最高的惡性腫瘤之一，是我國第二位癌癥殺手。盡管手術(shù)仍是目前治療肝癌最有效的方法，但術(shù)后高轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率已成為進(jìn)一步提高遠(yuǎn)期療效的瓶頸，降低術(shù)后復(fù)發(fā)率成為目前攻克肝癌的關(guān)鍵。甘露糖高表達(dá)是腫瘤細(xì)胞的重要特點(diǎn)之一，使得腫瘤細(xì)胞表面甘露糖成為腫瘤治療的一個重要靶點(diǎn)。甘露糖敏感型綠膿桿菌制劑(Pseudomonasaeruginosamannosesensitivehemagglutinationvaccine，P

2、A-MSHA)是一種新型的廣譜免疫調(diào)節(jié)劑，它可以與腫瘤細(xì)胞表面的甘露糖特異性結(jié)合，發(fā)揮抗腫瘤的作用。但其在肝癌中的作用尚待進(jìn)一步研究。我們前期研究發(fā)現(xiàn)PA-MSHA能顯著誘導(dǎo)肝細(xì)胞肝癌的凋亡并抑制其轉(zhuǎn)移。在此基礎(chǔ)上，本研究擬進(jìn)一步探索PA-MSHA對肝癌細(xì)胞周期的作用及其機(jī)制，為臨床開展應(yīng)用甘露糖敏感型綠膿桿菌制劑防治肝細(xì)胞肝癌提供理論依據(jù)和實(shí)踐基礎(chǔ)。
　　方怯:(1)采用人肝癌細(xì)胞MHCC97L和HepG2細(xì)胞系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，根據(jù)實(shí)

3、驗(yàn)需要，分為六組，分別為:對照組、甘露糖組(100mM)、滅活的普通綠膿桿菌(PA)組(2×108/ml)、低劑量PA-MSHA組(1×108/ml)、高劑量PA-MSHA組(2×108/ml)和高劑量PA-MSHA(2×108/ml)+甘露糖(100mM)組。
　　(2)觀察指標(biāo)及方法:體外培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞株MHCC97L及HepG2，以不同劑量的PA-MSHA作用于肝癌細(xì)胞，MTT實(shí)驗(yàn)檢測PA-MSHA對細(xì)胞增殖的影響，流式細(xì)胞

4、技術(shù)檢測PA-MSHA對細(xì)胞周期的作用，WesternBlot檢測PA-MSHA作用前后細(xì)胞周期蛋白CyclinD1，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2(CDK2)，增殖細(xì)胞核抗原(Proliferatingcellnuclearantigen，PCNA)和細(xì)胞周期蛋白激酶抑制劑p21和p27的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:(1)PA-MSHA可抑制肝癌細(xì)胞的增殖，其作用呈劑量及時間依賴性
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，PA對肝癌細(xì)胞的增殖

5、無明顯影響，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，而PA-MSHA可顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖，且這種抑制作用隨著PA-MSHA劑量的增大及作用時間的延長而增加(P＜0.05)。
　　(2)PA-MSHA可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞周期阻滯，其作用呈劑量依賴性
　　PA組和對照組對肝癌細(xì)胞周期的影響無顯著差異，此差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);而與對照組相比，經(jīng)PA-MSHA處理后的肝癌細(xì)胞G0-G1期和G2-M期細(xì)胞比例明顯增高，而S

6、期細(xì)胞比例則顯著下降(P＜0.05)。且PA-MSHA誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞周期阻滯的作用呈劑量依賴性，即高劑量PA-MSHA組誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯的作用顯著強(qiáng)于低劑量PA-MSHA組(P＜0.05)。
　　(3)外源性甘露糖可逆轉(zhuǎn)PA-MSHA對肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用及其誘導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯
　　與對照組相比，外源性甘露糖單獨(dú)使用對肝癌細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期無顯著影響，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);但高劑量PA-MSHA+甘露糖組與

7、高劑量PA-MSHA組相比，加入甘露糖后PA-MSHA抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用與誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞周期阻滯的作用顯著降低(P＜0.05)，說明PA-MSHA誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞周期阻滯的作用是通過甘露糖介導(dǎo)的。
　　(4)PA-MSHA可抑制CyclinD1、CyclinE、CDK2、CDK4及PCNA蛋白的表達(dá)，并促進(jìn)p21和p27的表達(dá)，外源性甘露糖可逆轉(zhuǎn)此作用
　　經(jīng)PA-MSHA處理后，CyclinD1、CyclinE、CDK2、C

8、DK4等細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換的正向調(diào)節(jié)因子的表達(dá)顯著降低，與對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05);但細(xì)胞周期負(fù)向調(diào)節(jié)因子p21和p27的表達(dá)較對照組明顯升高(P＜0.05)。此外，PA-MSHA處理可降低與細(xì)胞DNA合成密切相關(guān)的PCNA的表達(dá)(P＜0.05)。以上作用在高劑量PA-MSHA都較低劑量PA-MSHA明顯(P＜0.05)。高劑量PA-MSHA+甘露糖組與高劑量PA-MSHA組相比，前組中PA-MSHA對細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cycl

9、inD1、CyclinE、CDK2、CDK4及PCNA表達(dá)的抑制作用較后組降低;同樣，甘露糖也減弱了PA-MSHA對p21、p27的促進(jìn)作用(P＜0.05)。證明PA-MSHA對CyclinD1、CyclinE、CDK2、CDK4及PCNA等蛋白的表達(dá)具有抑制作用，并對p21、p27的表達(dá)有促進(jìn)作用，且該作用呈劑量依賴性，而外源性甘露糖則可抑制該作用。
　　結(jié)論:
　　(1)PA-MSHA通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白來誘導(dǎo)肝癌細(xì)