甘露糖敏感型綠膿桿菌制劑對肝癌細胞周期的作用機制研究.pdf

1、目的:肝癌是世界上最常見、惡性程度最高的惡性腫瘤之一，是我國第二位癌癥殺手。盡管手術(shù)仍是目前治療肝癌最有效的方法，但術(shù)后高轉(zhuǎn)移復發(fā)率已成為進一步提高遠期療效的瓶頸，降低術(shù)后復發(fā)率成為目前攻克肝癌的關(guān)鍵。甘露糖高表達是腫瘤細胞的重要特點之一，使得腫瘤細胞表面甘露糖成為腫瘤治療的一個重要靶點。甘露糖敏感型綠膿桿菌制劑(Pseudomonasaeruginosamannosesensitivehemagglutinationvaccine，P

2、A-MSHA)是一種新型的廣譜免疫調(diào)節(jié)劑，它可以與腫瘤細胞表面的甘露糖特異性結(jié)合，發(fā)揮抗腫瘤的作用。但其在肝癌中的作用尚待進一步研究。我們前期研究發(fā)現(xiàn)PA-MSHA能顯著誘導肝細胞肝癌的凋亡并抑制其轉(zhuǎn)移。在此基礎(chǔ)上，本研究擬進一步探索PA-MSHA對肝癌細胞周期的作用及其機制，為臨床開展應(yīng)用甘露糖敏感型綠膿桿菌制劑防治肝細胞肝癌提供理論依據(jù)和實踐基礎(chǔ)。
　　方怯:(1)采用人肝癌細胞MHCC97L和HepG2細胞系進行實驗，根據(jù)實

3、驗需要，分為六組，分別為:對照組、甘露糖組(100mM)、滅活的普通綠膿桿菌(PA)組(2×108/ml)、低劑量PA-MSHA組(1×108/ml)、高劑量PA-MSHA組(2×108/ml)和高劑量PA-MSHA(2×108/ml)+甘露糖(100mM)組。
　　(2)觀察指標及方法:體外培養(yǎng)人肝癌細胞株MHCC97L及HepG2，以不同劑量的PA-MSHA作用于肝癌細胞，MTT實驗檢測PA-MSHA對細胞增殖的影響，流式細胞

4、技術(shù)檢測PA-MSHA對細胞周期的作用，WesternBlot檢測PA-MSHA作用前后細胞周期蛋白CyclinD1，細胞周期蛋白依賴性激酶2(CDK2)，增殖細胞核抗原(Proliferatingcellnuclearantigen，PCNA)和細胞周期蛋白激酶抑制劑p21和p27的表達情況。
　　結(jié)果:(1)PA-MSHA可抑制肝癌細胞的增殖，其作用呈劑量及時間依賴性
　　實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，PA對肝癌細胞的增殖

5、無明顯影響，差異不具有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，而PA-MSHA可顯著抑制肝癌細胞的增殖，且這種抑制作用隨著PA-MSHA劑量的增大及作用時間的延長而增加(P＜0.05)。
　　(2)PA-MSHA可誘導肝癌細胞周期阻滯，其作用呈劑量依賴性
　　PA組和對照組對肝癌細胞周期的影響無顯著差異，此差異不具有統(tǒng)計學意義(P＞0.05);而與對照組相比，經(jīng)PA-MSHA處理后的肝癌細胞G0-G1期和G2-M期細胞比例明顯增高，而S

6、期細胞比例則顯著下降(P＜0.05)。且PA-MSHA誘導肝癌細胞周期阻滯的作用呈劑量依賴性，即高劑量PA-MSHA組誘導細胞周期阻滯的作用顯著強于低劑量PA-MSHA組(P＜0.05)。
　　(3)外源性甘露糖可逆轉(zhuǎn)PA-MSHA對肝癌細胞增殖的抑制作用及其誘導的細胞周期阻滯
　　與對照組相比，外源性甘露糖單獨使用對肝癌細胞的增殖和細胞周期無顯著影響，差異不具有統(tǒng)計學意義(P＞0.05);但高劑量PA-MSHA+甘露糖組與

7、高劑量PA-MSHA組相比，加入甘露糖后PA-MSHA抑制肝癌細胞增殖的作用與誘導肝癌細胞周期阻滯的作用顯著降低(P＜0.05)，說明PA-MSHA誘導肝癌細胞周期阻滯的作用是通過甘露糖介導的。
　　(4)PA-MSHA可抑制CyclinD1、CyclinE、CDK2、CDK4及PCNA蛋白的表達，并促進p21和p27的表達，外源性甘露糖可逆轉(zhuǎn)此作用
　　經(jīng)PA-MSHA處理后，CyclinD1、CyclinE、CDK2、C

8、DK4等細胞周期轉(zhuǎn)換的正向調(diào)節(jié)因子的表達顯著降低，與對照組相比具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05);但細胞周期負向調(diào)節(jié)因子p21和p27的表達較對照組明顯升高(P＜0.05)。此外，PA-MSHA處理可降低與細胞DNA合成密切相關(guān)的PCNA的表達(P＜0.05)。以上作用在高劑量PA-MSHA都較低劑量PA-MSHA明顯(P＜0.05)。高劑量PA-MSHA+甘露糖組與高劑量PA-MSHA組相比，前組中PA-MSHA對細胞周期相關(guān)蛋白Cycl

9、inD1、CyclinE、CDK2、CDK4及PCNA表達的抑制作用較后組降低;同樣，甘露糖也減弱了PA-MSHA對p21、p27的促進作用(P＜0.05)。證明PA-MSHA對CyclinD1、CyclinE、CDK2、CDK4及PCNA等蛋白的表達具有抑制作用，并對p21、p27的表達有促進作用，且該作用呈劑量依賴性，而外源性甘露糖則可抑制該作用。
　　結(jié)論:
　　(1)PA-MSHA通過調(diào)控細胞周期相關(guān)蛋白來誘導肝癌細