MCM7基因對人肝癌細胞周期的影響機制探究.pdf

1、第一部分構建慢病毒 RNA干擾載體沉默 MCM7基因的人肝癌 SMMC-7721、MHCC-97H、HepG2細胞模型
　　目的：構建穩(wěn)定沉默微小染色體維持蛋白7(mini-chromosome maintenance protein7,MCM7)基因的人肝癌SMMC-7721、MHCC-97H、HepG2細胞模型。
　　方法：通過構建能夠沉默MCM7基因表達的慢病毒RNA干擾載體，進行轉染人肝癌SMMC-7721、MHCC

2、-97H、HepG2細胞，進而沉默細胞中MCM7基因的表達。并通過實時熒光定量PCR及蛋白質印跡法驗證MCM7基因的沉默效率。
　　結果：構建出穩(wěn)定沉默MCM7基因的人肝癌SMMC-7721、MHCC-97H、HepG2細胞，經(jīng)驗證MCM7基因表達在mRNA及蛋白質表達水平均下調(diào)。
　　結論：本研究中利用慢病毒載體和RNA干擾技術構建的RNA干擾慢病毒顆粒，轉染人肝癌細胞后，經(jīng)過篩選，能夠成功構建穩(wěn)定沉默MCM7基因人肝癌細

3、胞系。
　　第二部分篩選干擾 MCM7基因后人肝癌 SMMC-7721細胞差異表達基因，并探究細胞周期相關基因的表達情況
　　目的:探究MCM7基因在調(diào)節(jié)人肝癌細胞周期中的相關機制。
　　方法:采用人全基因組表達譜芯片,篩選穩(wěn)定沉默MCM7基因后的人肝癌SMMC-7721細胞中的差異表達基因,并進行生物信息學分析。采用實時熒光定量PCR對篩選出的細胞周期通路中的差異表達基因及預測到可能參與MCM7調(diào)節(jié)機制的人泛素啟動子

4、UBB(ubiquitin b)的表達水平進行驗證。
　　結果:通過人基因表達譜芯片篩選出穩(wěn)定沉默MCM7基因的人肝癌SMMC-7721細胞中，差異表達基因1010個。其中上調(diào)基因391個,下調(diào)基因619個。生物信息學分析發(fā)現(xiàn)這些基因主要涉及生物大分子代謝、細胞周期調(diào)控、細胞增殖、細胞凋亡等方面，參與胞吞、腫瘤相關通路、P53信號通路、mTOR信號通路、細胞周期等通路的改變。篩選出細胞周期通路中差異表達基因10個，經(jīng)實時熒光定量P

5、CR證實，在沉默MCM7基因的人肝癌SMMC-7721、MHCC-97H、HwpG2細胞中，MCM7、SKP2、CCND1、TP53、MAD2L1、CDC45、CDK6、DBF4基因表達均發(fā)生下調(diào)；CDC25A基因在沉默MCM7基因后的SMMC-7721、HepG2細胞中表達下調(diào)，在沉默MCM7基因后的MHCC-97H細胞中表達未見差異；TTK基因在沉默MCM7基因后的SMMC-7721、MHCC-97H細胞中表達上調(diào)，在沉默MCM7基