中藥X對肺癌細胞增殖和細胞周期的影響.pdf

1、癌癥對人類健康和生命的威脅很大。在我國肺癌的發(fā)病率和死亡率高居所有惡性腫瘤首位，并以每年0.5％的速度增長。中醫(yī)中藥治療癌癥對于減輕病人的癥狀和痛苦，提高生存質(zhì)量，延長生命，降低死亡率，都有其重要的意義。我國學者近幾年來已開始進行中藥誘導腫瘤細胞凋亡的研究。目前為止，已發(fā)現(xiàn)多種中藥提取物在體外實驗中有誘導腫瘤細胞凋亡的作用。探討中藥誘導腫瘤細胞凋亡作用，將進一步揭示中醫(yī)藥治療腫瘤的機制，促進抗腫瘤研究向縱深發(fā)展。本研究室對中藥、天然藥物

2、的研究有著豐富的經(jīng)驗，已成功地從傳統(tǒng)中藥茵陳中提取主要有效成分，并有深入研究。本實驗中的中藥X也是重點研究的中藥之一，實驗中將對其抗腫瘤作用進行初步探討。 材料與方法一、實驗材料1.A549細胞株：人肺腺癌細胞株。 2.試劑：中藥X、優(yōu)級新生牛血清、胰蛋白酶、RPMI-1640培養(yǎng)基、碘化丙啶(PI)、RNA酶A、MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒。 3.實驗設備：流式細胞儀、倒置熒光顯微鏡、分析天平、離心機、二

3、氧化碳培養(yǎng)箱、超凈臺、電腦壓力蒸氣滅菌器。 二、實驗方法1.A549細胞的增殖抑制實驗收集細胞，使其成為單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為5×104個/ml；取一塊96孔培養(yǎng)板，每孔分別加入90μl的單細胞懸液，使每孔內(nèi)細胞數(shù)量約為4000～5000。用移液器將不同濃度的藥物和0.9％生理鹽水分別加入到單細胞懸液中，每組設有3個復孔，10μl/孔；將培養(yǎng)板放入C02培養(yǎng)箱內(nèi)，記錄時間，將經(jīng)過72h、48h、24h培養(yǎng)的細胞中加入MTT溶

4、液10μl，繼續(xù)孵育4h；然后加入100μl的formanzan溶解液，在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育過夜，直至在光學顯微鏡下觀察formanzan全部溶解；于570nm處測定各孔的吸光度A值。 2.A549細胞凋亡百分率和細胞周期分析收集細胞，使其成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為1～2×106個/ml；取12孔培養(yǎng)板，用微量移液器在每孔內(nèi)加入1.8ml的細胞懸液，然后分別將不同濃度的藥物和0.9％生理鹽水分別加入到單細胞懸液中，每組設有3個復

5、孔，200μl/孔；將培養(yǎng)板放入CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，記錄時間；將經(jīng)過72h、48h、24h培養(yǎng)的細胞分別收集到不同的5ml離心管內(nèi)，并標記；1000rpm，5min；棄掉上清液，加入1ml的70％的冰乙醇，固定細胞，置4℃冰箱過夜；然后1000rpm離心5min，棄掉上清液，每管內(nèi)分別加入1ml碘化丙啶染液，避光染色30min，流式細胞儀檢測。 3.統(tǒng)計學處理所有結(jié)果以-x±s表示，采用單因素方差分析(one-wayANOVA)，多

6、組間兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果1.中藥X對A549細胞的增殖抑制作用同一方法兩次實驗的結(jié)果基本一致，表明試驗具有可重復性。結(jié)果顯示各濃度的中藥X作用24h開始對A549細胞的增殖具有明顯的抑制作用，隨著作用時間的延長抑制作用逐漸增強，且呈現(xiàn)隨著給藥劑量的增大，抑制作用增強。兩次實驗中250μg/ml劑量組的抑制率分別達到88.78％和86.40％。 2.中藥X對A549細胞周期的影響同一

7、方法兩次實驗的結(jié)果基本一致，表明試驗具有可重復性。結(jié)果顯示S期和G2/M期細胞比例明顯下降，且隨著藥物劑量的增加下降的越顯著；而G0/G1期細胞的比例卻隨著藥物劑量的增加而逐漸增高。給藥時間對此影響不很明顯。表明中藥X可抑制細胞的增殖周期，使細胞生長被阻滯于G0/G1期，進入生長活躍的S期和G2/M期的細胞減少。 討論凋亡是細胞主動死亡的過程，是由基因介導的個別細胞發(fā)生的程序性細胞死亡。腫瘤的發(fā)生不僅是細胞增殖與分化的異常，同時

8、也是細胞凋亡機制的失常。細胞增殖和凋亡的動態(tài)平衡是多細胞生物維系其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、內(nèi)環(huán)境功能平衡以及生長發(fā)育所必需的最基本的生物學過程。細胞增殖和凋亡從正負兩個方面使各個組織和器官處于正常狀態(tài)，一旦兩者間的平衡失調(diào)就會出現(xiàn)疾病。而腫瘤的發(fā)生可能就是由于細胞增殖和凋亡的平衡失調(diào)造成，失調(diào)的程度可決定腫瘤是否發(fā)生，也可決定腫瘤發(fā)展的速度。因此近年來已發(fā)現(xiàn)許多藥物可通過抑制腫瘤細胞增殖、促進其凋亡，破壞增殖和凋亡的動態(tài)平衡來殺傷腫瘤細胞。中醫(yī)藥誘導

9、腫瘤細胞凋亡是一個新興的課題，其重要意義已為廣大學者所認同。中藥與細胞凋亡研究已取得了一些可喜的成果，其研究不斷深入.目前已由凋亡現(xiàn)象觀察過渡到分子水平、基因水平的研究，這對于揭示中藥作用機制、篩選抗腫瘤新藥，均具有十分重要的意義。本實驗中各濃度的中藥X從作用24h開始對A549細胞的增殖具有明顯的抑制作用，隨著作用時間的延長抑制作用逐漸增強，且呈現(xiàn)隨著給藥劑量的增大，抑制作用逐漸增強。兩次實驗中250μg/ml劑量組的抑制率分別達到8

10、8.78％和86.40％。在流式細胞儀檢測細胞凋亡和細胞周期的實驗中。結(jié)果顯示S期和G2/M期細胞比例明顯下降，且隨著藥物劑量的增加下降的越顯著；而G0/G1期細胞的比例卻隨著藥物劑量的增加而逐漸增高。給藥時間對此影響不很明顯。兩次實驗中250μg/ml劑量組的細胞凋亡百分率最高時分別達到16.08％和15.44％；G0/G1期細胞所占的百分比在250μg/ml劑量時最高分別達到79.21％和74.50％，而對照組G0/G1期細胞所占的

11、百分比分別為49.16％和50.53％，兩者比較P＜0.01，有顯著性差異；S期細胞所占百分比在250μg/ml劑量時分別達到15.70％和20.37％，而對照組S期細胞所占的百分比分別為43.14％和39.68％，兩者比較P＜0.01，有顯著性差異；G22/M期細胞所占的百分比分別為5.09％和5.13％，而對照組G2/M期細胞所占的百分比分別為9.79％和7.69％，兩者比較P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義。以上結(jié)果均是中藥作用于A5

12、49細胞72h后產(chǎn)生的?？梢娝幬锸亲饔糜谠鲋潮容^活躍的DNA合成期和有絲分裂期，也就是說作用于S期和G2/M期。隨著藥物濃度的增加，S期和G2/M期細胞比例明顯下降，G0/G1期細胞的比例明顯升高，結(jié)果細胞被阻滯于G0/G1期。腫瘤細胞DNA合成減少，藥物抑制了腫瘤細胞的生長，產(chǎn)生抗腫瘤作用。具有潛在藥用價值，值得進一步深入研究。 結(jié)論中藥X在體外對肺癌細胞具有抑制作用，通過抑制DNA合成，將細胞阻滯于G0/G1期，從而抑制細胞