中藥X對(duì)肺癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響.pdf

1、癌癥對(duì)人類健康和生命的威脅很大。在我國(guó)肺癌的發(fā)病率和死亡率高居所有惡性腫瘤首位，并以每年0.5％的速度增長(zhǎng)。中醫(yī)中藥治療癌癥對(duì)于減輕病人的癥狀和痛苦，提高生存質(zhì)量，延長(zhǎng)生命，降低死亡率，都有其重要的意義。我國(guó)學(xué)者近幾年來(lái)已開始進(jìn)行中藥誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的研究。目前為止，已發(fā)現(xiàn)多種中藥提取物在體外實(shí)驗(yàn)中有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。探討中藥誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用，將進(jìn)一步揭示中醫(yī)藥治療腫瘤的機(jī)制，促進(jìn)抗腫瘤研究向縱深發(fā)展。本研究室對(duì)中藥、天然藥物

2、的研究有著豐富的經(jīng)驗(yàn)，已成功地從傳統(tǒng)中藥茵陳中提取主要有效成分，并有深入研究。本實(shí)驗(yàn)中的中藥X也是重點(diǎn)研究的中藥之一，實(shí)驗(yàn)中將對(duì)其抗腫瘤作用進(jìn)行初步探討。 材料與方法一、實(shí)驗(yàn)材料1.A549細(xì)胞株：人肺腺癌細(xì)胞株。 2.試劑：中藥X、優(yōu)級(jí)新生牛血清、胰蛋白酶、RPMI-1640培養(yǎng)基、碘化丙啶(PI)、RNA酶A、MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒。 3.實(shí)驗(yàn)設(shè)備：流式細(xì)胞儀、倒置熒光顯微鏡、分析天平、離心機(jī)、二

3、氧化碳培養(yǎng)箱、超凈臺(tái)、電腦壓力蒸氣滅菌器。 二、實(shí)驗(yàn)方法1.A549細(xì)胞的增殖抑制實(shí)驗(yàn)收集細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/ml；取一塊96孔培養(yǎng)板，每孔分別加入90μl的單細(xì)胞懸液，使每孔內(nèi)細(xì)胞數(shù)量約為4000～5000。用移液器將不同濃度的藥物和0.9％生理鹽水分別加入到單細(xì)胞懸液中，每組設(shè)有3個(gè)復(fù)孔，10μl/孔；將培養(yǎng)板放入C02培養(yǎng)箱內(nèi)，記錄時(shí)間，將經(jīng)過(guò)72h、48h、24h培養(yǎng)的細(xì)胞中加入MTT溶

4、液10μl，繼續(xù)孵育4h；然后加入100μl的formanzan溶解液，在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育過(guò)夜，直至在光學(xué)顯微鏡下觀察formanzan全部溶解；于570nm處測(cè)定各孔的吸光度A值。 2.A549細(xì)胞凋亡百分率和細(xì)胞周期分析收集細(xì)胞，使其成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1～2×106個(gè)/ml；取12孔培養(yǎng)板，用微量移液器在每孔內(nèi)加入1.8ml的細(xì)胞懸液，然后分別將不同濃度的藥物和0.9％生理鹽水分別加入到單細(xì)胞懸液中，每組設(shè)有3個(gè)復(fù)

5、孔，200μl/孔；將培養(yǎng)板放入CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，記錄時(shí)間；將經(jīng)過(guò)72h、48h、24h培養(yǎng)的細(xì)胞分別收集到不同的5ml離心管內(nèi)，并標(biāo)記；1000rpm，5min；棄掉上清液，加入1ml的70％的冰乙醇，固定細(xì)胞，置4℃冰箱過(guò)夜；然后1000rpm離心5min，棄掉上清液，每管內(nèi)分別加入1ml碘化丙啶染液，避光染色30min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有結(jié)果以-x±s表示，采用單因素方差分析(one-wayANOVA)，多

6、組間兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果1.中藥X對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制作用同一方法兩次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果基本一致，表明試驗(yàn)具有可重復(fù)性。結(jié)果顯示各濃度的中藥X作用24h開始對(duì)A549細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)抑制作用逐漸增強(qiáng)，且呈現(xiàn)隨著給藥劑量的增大，抑制作用增強(qiáng)。兩次實(shí)驗(yàn)中250μg/ml劑量組的抑制率分別達(dá)到88.78％和86.40％。 2.中藥X對(duì)A549細(xì)胞周期的影響同一

7、方法兩次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果基本一致，表明試驗(yàn)具有可重復(fù)性。結(jié)果顯示S期和G2/M期細(xì)胞比例明顯下降，且隨著藥物劑量的增加下降的越顯著；而G0/G1期細(xì)胞的比例卻隨著藥物劑量的增加而逐漸增高。給藥時(shí)間對(duì)此影響不很明顯。表明中藥X可抑制細(xì)胞的增殖周期，使細(xì)胞生長(zhǎng)被阻滯于G0/G1期，進(jìn)入生長(zhǎng)活躍的S期和G2/M期的細(xì)胞減少。 討論凋亡是細(xì)胞主動(dòng)死亡的過(guò)程，是由基因介導(dǎo)的個(gè)別細(xì)胞發(fā)生的程序性細(xì)胞死亡。腫瘤的發(fā)生不僅是細(xì)胞增殖與分化的異常，同時(shí)

8、也是細(xì)胞凋亡機(jī)制的失常。細(xì)胞增殖和凋亡的動(dòng)態(tài)平衡是多細(xì)胞生物維系其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、內(nèi)環(huán)境功能平衡以及生長(zhǎng)發(fā)育所必需的最基本的生物學(xué)過(guò)程。細(xì)胞增殖和凋亡從正負(fù)兩個(gè)方面使各個(gè)組織和器官處于正常狀態(tài)，一旦兩者間的平衡失調(diào)就會(huì)出現(xiàn)疾病。而腫瘤的發(fā)生可能就是由于細(xì)胞增殖和凋亡的平衡失調(diào)造成，失調(diào)的程度可決定腫瘤是否發(fā)生，也可決定腫瘤發(fā)展的速度。因此近年來(lái)已發(fā)現(xiàn)許多藥物可通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡，破壞增殖和凋亡的動(dòng)態(tài)平衡來(lái)殺傷腫瘤細(xì)胞。中醫(yī)藥誘導(dǎo)

9、腫瘤細(xì)胞凋亡是一個(gè)新興的課題，其重要意義已為廣大學(xué)者所認(rèn)同。中藥與細(xì)胞凋亡研究已取得了一些可喜的成果，其研究不斷深入.目前已由凋亡現(xiàn)象觀察過(guò)渡到分子水平、基因水平的研究，這對(duì)于揭示中藥作用機(jī)制、篩選抗腫瘤新藥，均具有十分重要的意義。本實(shí)驗(yàn)中各濃度的中藥X從作用24h開始對(duì)A549細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)抑制作用逐漸增強(qiáng)，且呈現(xiàn)隨著給藥劑量的增大，抑制作用逐漸增強(qiáng)。兩次實(shí)驗(yàn)中250μg/ml劑量組的抑制率分別達(dá)到8

10、8.78％和86.40％。在流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的實(shí)驗(yàn)中。結(jié)果顯示S期和G2/M期細(xì)胞比例明顯下降，且隨著藥物劑量的增加下降的越顯著；而G0/G1期細(xì)胞的比例卻隨著藥物劑量的增加而逐漸增高。給藥時(shí)間對(duì)此影響不很明顯。兩次實(shí)驗(yàn)中250μg/ml劑量組的細(xì)胞凋亡百分率最高時(shí)分別達(dá)到16.08％和15.44％；G0/G1期細(xì)胞所占的百分比在250μg/ml劑量時(shí)最高分別達(dá)到79.21％和74.50％，而對(duì)照組G0/G1期細(xì)胞所占的

11、百分比分別為49.16％和50.53％，兩者比較P＜0.01，有顯著性差異；S期細(xì)胞所占百分比在250μg/ml劑量時(shí)分別達(dá)到15.70％和20.37％，而對(duì)照組S期細(xì)胞所占的百分比分別為43.14％和39.68％，兩者比較P＜0.01，有顯著性差異；G22/M期細(xì)胞所占的百分比分別為5.09％和5.13％，而對(duì)照組G2/M期細(xì)胞所占的百分比分別為9.79％和7.69％，兩者比較P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果均是中藥作用于A5

12、49細(xì)胞72h后產(chǎn)生的?？梢娝幬锸亲饔糜谠鲋潮容^活躍的DNA合成期和有絲分裂期，也就是說(shuō)作用于S期和G2/M期。隨著藥物濃度的增加，S期和G2/M期細(xì)胞比例明顯下降，G0/G1期細(xì)胞的比例明顯升高，結(jié)果細(xì)胞被阻滯于G0/G1期。腫瘤細(xì)胞DNA合成減少，藥物抑制了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，產(chǎn)生抗腫瘤作用。具有潛在藥用價(jià)值，值得進(jìn)一步深入研究。 結(jié)論中藥X在體外對(duì)肺癌細(xì)胞具有抑制作用，通過(guò)抑制DNA合成，將細(xì)胞阻滯于G0/G1期，從而抑制細(xì)胞