細(xì)胞周期調(diào)控蛋白hcdc14A對平滑肌細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、第一部分 hcdc14A在不同條件下人平滑肌等細(xì)胞中的表達(dá)變化
　　 目的：觀察hcdc14A在人平滑肌等細(xì)胞中不同干預(yù)條件下的表達(dá)變化。
　　 方法：利用XTT法和細(xì)胞動態(tài)分析儀觀察細(xì)胞在葡萄糖刺激下增殖能力的變化。分別用不同條件的高葡萄糖和胰島素干預(yù)人平滑肌細(xì)胞。此外，還應(yīng)用葡萄糖，LDL以及FFA干預(yù)人巨噬細(xì)胞。提取細(xì)胞蛋白后，應(yīng)用western blot法檢測細(xì)胞中hcdc14A的蛋白表達(dá)水平。
　　 結(jié)

2、果：平滑肌細(xì)胞在葡萄糖刺激下增殖能力增加。葡萄糖和胰島素干預(yù)平滑肌細(xì)胞后，hcdc14A蛋白的表達(dá)水平有所增加。不同條件干預(yù)人巨噬細(xì)胞后，hcdc14A的蛋白表達(dá)水平也有上升趨勢。
　　 結(jié)論：在糖、胰島素等條件干預(yù)下，細(xì)胞增殖能力增強，并且hcdc14A表達(dá)量有所增加，這一現(xiàn)象提示hcdc14A的高表達(dá)可能通過對抗Cdk/cyclin活性的增強，促進(jìn)了細(xì)胞有絲分裂的退出，從而加速細(xì)胞周期進(jìn)程，使細(xì)胞進(jìn)入又一輪新的有絲分裂周期，

3、或者影響細(xì)胞內(nèi)信號通路的傳遞，最終導(dǎo)致細(xì)胞的增殖增加。此外，hcdc14A的高表達(dá)還可能導(dǎo)致細(xì)胞正常生理功能的異常，在糖尿病血管平滑肌細(xì)胞病變中可能發(fā)揮了一定作用。
　　 第二部分 hcdc14A與細(xì)胞周期蛋白在平滑肌細(xì)胞中的相互作用
　　 目的：觀察hcdc14A與細(xì)胞周期蛋白在平滑肌細(xì)胞中的相互作用。
　　 方法：高葡萄糖、高胰島素干預(yù)平滑肌細(xì)胞后，提取細(xì)胞蛋白，應(yīng)用western blot法檢測細(xì)胞周期蛋白

4、cyclinB和P53的表達(dá)。構(gòu)建hcdc14A的真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后觀察其定位，并檢測過表達(dá)hcdc14A后，cyclinB和P53的表達(dá)量是否有相應(yīng)的變化。
　　 結(jié)果：高葡萄糖和胰島素干預(yù)平滑肌細(xì)胞后，細(xì)胞周期蛋白cyclinB和P53的表達(dá)水平均有所增加。hcdc14A的真核表達(dá)載體構(gòu)建成功，其定位在細(xì)胞中心體上。過表達(dá)hcdc14A可使P53表達(dá)量增多，而cyclinB則無明顯變化。
　　 結(jié)論：Hcdc1

5、4A和cyclinB在高糖、高胰島素刺激下，可能存在相互協(xié)同的作用，分別促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂的退出和進(jìn)入，對平滑肌細(xì)胞正常的有絲分裂進(jìn)程有所影響。而hcdc14A一方面可使p53去磷酸化，對抗cyclin/Cdk的活性，另一方面環(huán)境刺激和hcdc14A的表達(dá)量改變也可能使細(xì)胞內(nèi)突變型P53增加，影響野生型P53的作用，從而促凋亡的能力減弱。因此，細(xì)胞周期蛋白和hcdc14A在血管平滑肌細(xì)胞的病變中可能協(xié)同發(fā)揮了一定的作用。
　　 第

6、三部分 hcdc14A相互作用蛋白的驗證
　　 目的：驗證通過酵母雙雜交篩選出的與hcdc14A相互作用的蛋白Zipk。
　　 方法：構(gòu)建各種真核與大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒后，利用體外Pulldown試驗和免疫共沉淀試驗驗證hcdc14A和Zipk間的相互作用。并且兩種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)細(xì)胞后，觀察其共定位情況。
　　 結(jié)果：體外Pulldown試驗和免疫共沉淀試驗結(jié)果提示兩者確實可以相互作用，并且發(fā)現(xiàn)Zipk可以與hcdc14A

7、的N端(磷酸酶活性端)相互結(jié)合。hcdc14A和Zipk的表達(dá)質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)入Hela細(xì)胞后，我們觀察到兩者有共同的細(xì)胞內(nèi)定位。
　　 結(jié)論：研究結(jié)果已經(jīng)證實hcdc14A和Zipk有相互作用，為尋找調(diào)控hcdc14A的蛋白打下一定的基礎(chǔ)。而已知的Zipk蛋白的功能，可能對hcdc14A有所調(diào)控。Zipk蛋白對hcdc14A的調(diào)控作用，以及自身促進(jìn)平滑肌收縮的功能可能在血管平滑肌病變中也起了一定的作用。
　　 第四部分 Zi

8、pk在平滑肌中的表達(dá)及其對hcdc14A的調(diào)控
　　 目的：觀察糖、胰島素刺激后，Zipk在平滑肌中的表達(dá)，并進(jìn)一步研究Zipk與hcdc14A的相互作用。
　　 方法：構(gòu)建各種質(zhì)粒后，分別共轉(zhuǎn)細(xì)胞以觀察兩者定位的變化，初步判斷蛋白的相互作用。高葡萄糖、高胰島素干預(yù)平滑肌細(xì)胞后，提取細(xì)胞蛋白，利用western blot法檢測細(xì)胞Zipk的表達(dá)變化。過表達(dá)Zipk后，檢測hcdc14A的表達(dá)量是否有相應(yīng)的變化。
　

9、　 結(jié)果：共轉(zhuǎn)Zipk和hcdc14A-N端(磷酸酶活性端)質(zhì)粒后，Zipk改變了hcdc14A-N端在細(xì)胞內(nèi)的定位，使其從細(xì)胞核上釋放到了細(xì)胞漿內(nèi)。而Zipk-KD(激酶失活質(zhì)粒)并不能影響hcdc14A-N端的定位。葡萄糖干預(yù)平滑肌細(xì)胞后，Zipk表達(dá)量增加。而胰島素干預(yù)之后，其表達(dá)量則有所減少。過表達(dá)Zipk可使hcdc14A的表達(dá)增加。
　　 結(jié)論：Zipk和hcdc14A的共定位可能依賴于Zipk的激酶活性，Zipk