哮喘人氣道平滑肌細(xì)胞中蛋白激酶Cα對周期蛋白D1的影響及其對細(xì)胞增殖調(diào)控的研究.pdf

1、哮喘是一種以氣道高反應(yīng)性，氣道炎癥和氣道重建為特征的慢性疾病，目前患病率顯著性增高，并且被認(rèn)為是喪失勞動能力、醫(yī)療消費(fèi)和可預(yù)防性死亡的主要原因之一。到目前為止許多研究機(jī)構(gòu)已經(jīng)證實(shí)：在慢性哮喘，氣道平滑肌在誘導(dǎo)氣道重建中起著主要作用。氣道平滑肌細(xì)胞的反常增殖導(dǎo)致了氣道重建和氣道高反應(yīng)性，但是其具體的機(jī)制目前還不很清楚。 蛋白激酶C（PKC）是一絲氨酸-蘇氨酸激酶家族，它包括三種類型的異構(gòu)體。傳統(tǒng)型(α,β1,β2和γ)可被鈣、佛波酯

2、和磷脂酰絲氨酸所激活；新型(δ,ε,η,θ，and μ)對鈣不敏感，但可被佛波酯和磷脂酰絲氨酸所激活；不典型型(ζandτ/λ)對鈣和佛波酯不敏感，但可被磷脂酰絲氨酸激活。人氣道平滑肌細(xì)胞表達(dá)PKCα,β1,β2,δ,ε,andζ。不同的異構(gòu)體的體外激酶活性特征以及組織分布、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)是有差別的。這些異構(gòu)體參與信號通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡、遷徙和粘附。許多研究者已經(jīng)證明：PKC的激活是ASMCs增殖的必需事件，并且，不同的PKC異

3、構(gòu)體在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖中起著不同的作用。在NIH3T3細(xì)胞，PKCε是一強(qiáng)有力的生長刺激因素，而PKCα和δ抑制生長。在A7r5血管平滑肌細(xì)胞，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞，PKCδ也抑制細(xì)胞周期進(jìn)展。在血管平滑肌細(xì)胞，PKCδ的過度表達(dá)抑制G1期周期蛋白的表達(dá)，這與PKCδ控制周期蛋白D1的轉(zhuǎn)錄的假設(shè)一致。在人，牛和鼠氣道平滑肌細(xì)胞，PKCδ負(fù)性調(diào)節(jié)cyclinD1的轉(zhuǎn)錄。本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)證實(shí)：PKCα參與哮喘血清被動致敏的人氣道平滑肌細(xì)

4、胞增殖。 然而，PKCα調(diào)節(jié)的下游機(jī)制目前還不清楚。細(xì)胞周期進(jìn)展是細(xì)胞增殖的的基本事件，目前已經(jīng)有一些關(guān)于ASMCs中調(diào)節(jié)特殊細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究。cyclinD（D1，D2和D3）是哺乳動物細(xì)胞G1期進(jìn)展的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，cyclinD1是許多生長刺激信號通路的靶基因。 那么，在哮喘人氣道平滑肌細(xì)胞，cyclinD1是否起關(guān)鍵作用？PKCα是否可通過調(diào)節(jié)cyclinD1表達(dá)來影響ASMC增殖?為此，本文利

5、用哮喘血清被動致敏的細(xì)胞模型來研究這些問題。 研究內(nèi)容： 1. 用10％哮喘患者血清被動致敏人氣道平滑肌細(xì)胞（HASMCs）(B組)，以10％非哮喘者血清為對照(A組)。構(gòu)建cyclinD1正、反義真核表達(dá)載體質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染干預(yù) HASMC。用RT-PCR方法以及Western Blot方法檢測cyclinD1的mRNA及蛋白表達(dá)水平，用流式細(xì)胞術(shù)、四甲基偶氮唑鹽（MTT）法及增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測H

6、ASMC增殖。 2.生長融合、同步后的HASMCs用哮喘血清致敏后，分為對照組，PMA組和PMA＋Go6976組。干預(yù)24小時后，用3H－TdR摻入法和MTT法檢測細(xì)胞增殖；用碘化丙啶單染法流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期；用RT-PCR和western blotting檢測cyclinD1mRNA和蛋白的表達(dá)。進(jìn)一步，還通過轉(zhuǎn)染重組的反義cyclinD1質(zhì)粒(PCDNA3.1(+)/as-cyclinD1)來降低cyclinD1基因的表

7、達(dá)后，檢測PKCα對HASMCs增殖的影響。 3. 用10％哮喘患者血清被動致敏人氣道平滑肌細(xì)胞（HASMCs），予以PKC激活劑PMA刺激。分別以反義寡核苷酸(PKCα-asODN)和特異性阻斷劑U0126抑制PKCα和ERK的表達(dá)，用RT-PCR方法及Western Blot方法檢測干預(yù)前后cyclinD1和P21cip1的mRNA及蛋白表達(dá)水平，用流式細(xì)胞術(shù)和四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測HASMCs增殖。 4.

8、用10％哮喘患者血清被動致敏人氣道平滑肌細(xì)胞（HASMCs），予以PKC激活劑PMA刺激。分別以反義寡核苷酸(PKCα-asODN)和PDTC抑制PKCα表達(dá)和NF-κB活化。用凝膠電泳遷移率改變試驗(yàn)（EMSA）檢測HASMCs中NF-κB的活性，用RT-PCR方法及Western Blot方法檢測干預(yù)前后cyclinD1的mRNA及蛋白表達(dá)水平，用流式細(xì)胞術(shù)和四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測HASMCs增殖。 結(jié)果： 1

9、.正常血清對照組細(xì)胞S期細(xì)胞比例、MTT吸光度值（A值）、PCNA表達(dá)陽率分別為(10.52±1.50)％、0.303±0.024和(39.4±8.53)％；哮喘血清組(B0組)細(xì)胞S期細(xì)胞比例、MTT吸光度值（A值）、PCNA表達(dá)陽率分別為（15.94±2.13）％、0.431±0.047和(53.2±7.5)％，均較對照血清組（A組）明顯增加(n=5,P<0.05)；轉(zhuǎn)染重組cyclinD1正義質(zhì)粒組（B2組）細(xì)胞S期細(xì)胞比例、MT

10、T吸光度值（A值）、PCNA表達(dá)陽性分別為(26.10±2.16)％、0.591±0.042和（84.2±5.9）％，均較哮喘血清組（B0組）明顯增加(n=5,P<0.05)；而轉(zhuǎn)染反義質(zhì)粒組(B3組)上述結(jié)果分別為（6.96±1.25）％、0.220±0.027和(29.8±8.2)％，均較哮喘血清組（B0組）明顯下降（n=5,P<0.05）。 2. PMA激活PKCα后上調(diào)cyclinD1表達(dá)和細(xì)胞增殖。而用Go6976特異

11、性抑制PKCα活性后，這種促cyclinD1表達(dá)和細(xì)胞增殖的作用顯著性下降。相反，PMA和Go6976對周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）的表達(dá)無明顯影響。另外，轉(zhuǎn)染反義cyclinD1質(zhì)粒后消除了PMA誘導(dǎo)的G1/S期進(jìn)展和HASMCs增殖效應(yīng)。 3. PMA刺激后磷酸化PKCα（p-PKCα）水平增高，ERK1/2，p-ERK1/2蛋白水平增高，cyclin D1、P21cip1表達(dá)明顯增強(qiáng)，HASMCs的增殖增強(qiáng)；而反義PK

12、Cα寡核苷酸轉(zhuǎn)入細(xì)胞抑制p-PKCα表達(dá)后，ERK1/2，p-ERK1/2表達(dá)明顯減弱，cyclin D1、P21cip1表達(dá)也明顯下降，HASMCs的增殖減弱(P<0.05,n=4)；用U0126抑制ERK1/2表達(dá)后，PMA刺激下p-PKCα水平仍然明顯增高，但cyclin D1、P21cip1的表達(dá)明顯下降，HASMCs的增殖減弱(P<0.05,n=4).。 4. PMA刺激后磷酸化PKCα(p-PKCα)水平增高，NF-

13、κB-DNA結(jié)合活性增強(qiáng)，cyclin D1表達(dá)明顯增強(qiáng)，HASMCs的增殖增強(qiáng)；而反義PKCα寡核苷酸轉(zhuǎn)入細(xì)胞特異性地抑制PΚCα表達(dá)后,p-PKCα水平下降，NF-κB-DNA結(jié)合活性明顯減弱，cyclin D1也明顯下降，HASMCs的增殖減弱(P<0.05,n=4)；用PDTC抑制NF-κB活性后，PMA刺激下p-PΚCα水平仍然明顯增高，但 cyclin D1的表達(dá)明顯下降，HASMCs的增殖減弱(P<0.05,n=4)。

14、 結(jié)論： 1. cyclinD1 促進(jìn)哮喘血清被動致敏的HASMC的增殖。cyclinD1可能是哮喘HASMC增殖的重要調(diào)控蛋白。 2. PKCα可通過上調(diào)cyclinD1表達(dá)而促進(jìn)哮喘血清被動致敏的人氣道平滑肌細(xì)胞增殖。 3. ERK1/2是PKCα的下游信號分子，PKCα-ERK1/2級聯(lián)參與了PMA所誘導(dǎo)的哮喘血清被動致敏的人氣道平滑細(xì)胞cyclin D1、P21cip1的表達(dá)上調(diào)及細(xì)胞增殖。

15、4. NF-κB是PKCα的下游信號分子，PΚCα-NF-κB級聯(lián)參與了PMA所誘導(dǎo)的哮喘血清被動致敏的人氣道平滑細(xì)胞cyclin D1的表達(dá)上調(diào)及細(xì)胞增殖。 綜上所述，上述結(jié)果表明：PKCα、cyclinD1參與了哮喘HASMC的增殖調(diào)控,并存在PKCα-ERK1/2-cyclinD1、PΚCα-NF-κβ-cyclinD1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從不同環(huán)節(jié)阻斷這一信號途徑對于針對性地抑制哮喘氣道平滑肌增殖、減輕氣道重建可能具有積極意義