香煙煙霧對人氣道平滑肌細胞增殖和凋亡失衡的影響及機制研究.pdf

1、目的： 1．觀察在不同濃度及時間的香煙煙霧作用下,人氣道平滑肌細胞增殖和凋亡的變化趨勢； 2. 探討香煙煙霧促進人氣道平滑肌細胞增殖/凋亡失衡是否通過線粒體凋亡途徑或死亡受體途徑進行，及是否受Bcl-2家族和TNFR超家族的調(diào)控； 3．探討在香煙煙霧作用下，人氣道平滑肌細胞中ROS的變化是否調(diào)控細胞周期調(diào)控因子NF-κB的表達，進而影響平滑肌細胞的增殖和凋亡。 材料與方法： 本實驗采用組織塊貼壁法

2、原代培養(yǎng)人氣道平滑肌細胞（HASMCs），用胰蛋白酶消化法傳代細胞，并將HASMCs隨機分成4個時間干預(yù)組：2.5％CSE、5％CSE、10％CSE和20％CSE組，3個時間干預(yù)組：24小時、48小時和72小時組及對照組。用四甲基偶氮唑藍（MTT）比色法和增殖細胞核抗原（PCNA）免疫細胞化學(xué)染色法檢測不同組細胞的增殖程度和活性情況。AO/EB熒光染色和流式細胞術(shù)分別檢測細胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化和細胞周期動力學(xué)變化。運用實時熒光定量聚合酶鏈

3、反應(yīng)（Realtime- PCR）檢測不同濃度和時間CSE作用下Bcl-2、Bax、Bad、Fas、FasL和NF-κB在mRNA水平的變化。用免疫細胞化學(xué)法檢測不同濃度CSE作用后Bcl-2和Bax在蛋白水平的變化。用硝基四氮唑藍（NBT）還原實驗和DCFH－DA熒光染色法檢測HASMCs中活性氧（ROS）的表達水平。 結(jié)果： 1. 除了2.5％CSE 24小時干預(yù)組細胞有少許促增殖作用外，CSE對HASMC的增殖主要

4、起著抑制作用，且隨著作用時間的延長和CSE濃度的增加，細胞增殖受抑的程度也增加，細胞增殖速度減慢，呈劑量－效應(yīng)關(guān)系和時間－效應(yīng)關(guān)系（n=6,P<0.05）。 2. 與對照組比較，AO/EB染色結(jié)果顯示：隨著CSE干預(yù)濃度的增高，HASMC的凋亡和壞死率均增加，但是凋亡細胞占據(jù)死亡細胞的大多數(shù)。流式細胞周期分析顯示：10％CSE作用于HASMC不同時段以后，隨著作用時間的延長，與對照組（1.74±0.21）相比，24小時組（2.3

5、6±0.24），48小時組（7.02±0.39）和72小時組（17.39±0.87）亞G1期的凋亡細胞所占的比例呈增加的趨勢（n=6,P<0.01）；不同濃度的CSE作用于HASMC 48h以后，可見隨著CSE濃度的增加，與對照組（1.74±0.21）比較，2.5％CSE組（2.46±0.11），5％CSE組（3.01±0.15），10％CSE組（7.02±0.39）和20％CSE組（13.48±0.52）處于亞G1期的凋亡細胞所占比例

6、呈增加趨勢（n=6,P<0.01）。 3. 與對照組比較，CSE各干預(yù)組中Bcl-2 mRNA水平表達下降，Bax、Fas mRNA水平表達上升，且呈時間和濃度依賴性（n=3,P<0.05）；Bad mRNA水平表達在各CSE濃度干預(yù)組均呈濃度依賴性升高，但不呈規(guī)律的時間依賴性（n=3,P<0.05）；FasL mRNA水平表達無明顯變化。 4. 與對照組比較，CSE各干預(yù)組中Bcl-2和Bax的蛋白表達水平分別呈濃度和

7、時間依賴性降低和增高（n=3,P<0.05）。 5．與對照組比較，各CSE干預(yù)組HASMC胞內(nèi)及總的ROS含量呈時間和濃度依賴性升高（n=6,P<0.05），NF-κB在mRNA水平表達除在2.5％CSE 24小時組表達增高以外，在其余各組的表達呈時間和濃度依賴型降低（n=3,P<0.05），NF－κB的P65亞基和P50亞基的表達一致，均符合上述規(guī)律。 結(jié)論： 低濃度（﹤2.5％CSE）短時間（24小時內(nèi)）香煙

8、煙霧作用下可引起人氣道平滑肌細胞增殖，超過此濃度和時間范圍外，香煙煙霧則抑制氣道平滑肌細胞的增殖及促進其凋亡并呈CSE時間和濃度依賴性。細胞凋亡的水平與Bcl-2家族抗凋亡基因（Bcl-2）/促凋亡基因（Bax、Bad）比例失衡，Bcl-2/Bax蛋白表達比例失衡以及TNFR超家族中Fas基因表達增加相關(guān)。并且，隨著CSE干預(yù)濃度和時間的增加，HASMCs內(nèi)ROS的含量亦隨之增加，其在低水平條件下可以促進NF-κB基因表達的增加，在高水

9、平條件下則抑制NF-κB基因的表達，這種變化趨勢與細胞的增殖和凋亡趨勢相符。這些說明：1.除了在較低濃度條件下以外，CSE對HASMC的主要作用是抑制增殖和促進凋亡引起增殖/凋亡比例失衡，這可能是吸煙COPD患者發(fā)病的重要作用機制；2.在HASMCs中，香煙煙霧對其的促凋亡作用可以通過線粒體途徑和死亡受體途徑進行，但是線粒體途徑的作用較死亡受體途徑更為明顯；3.氣道平滑肌細胞中ROS含量是與香煙煙霧的濃度和作用時間成正比增加的，但是RO