腫瘤抑制基因PTEN過表達對體外培養(yǎng)的人氣道平滑肌細胞增殖的影響.pdf

1、一.研究背景： 氣道重塑是支氣管哮喘基本特征之一，將氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性聯(lián)系起來。氣道重塑指的是哮喘中發(fā)生于氣道壁的結(jié)構(gòu)改變，這些改變包括上皮細胞的增生和化生，上皮下纖維化，肌細胞增生和血管發(fā)生。而氣道平滑肌細胞(airwaysmoothmusclecell，ASMC)是氣道重塑的主要結(jié)構(gòu)成分之一。哮喘時ASMC生物學(xué)特性發(fā)生很大變化，包括增生，肥大，遷移等，不僅使支氣管對刺激的收縮反應(yīng)更強烈，加重氣道高反應(yīng)性，而且增殖的AS

2、MC使氣道壁增厚，導(dǎo)致基礎(chǔ)氣道阻力增加和不可逆性氣流阻塞的發(fā)生。遺憾的是，當前尚無可以阻止或逆轉(zhuǎn)氣道重塑和其對肺功能影響的有效治療。因此迫切需要深入了解氣道重塑時ASMC的增殖和遷移等機制，尋找抑制其增殖和遷移等的靶點，為尋找新的阻止甚至逆轉(zhuǎn)氣道重塑的藥物提供理論和實驗依據(jù)。 與張力蛋白和輔助蛋白同源，第10號染色體丟失的磷酸酶基因(phophataseandtensinhomologdeletedonchromosone10，

3、PTEN)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的抑癌基因，是至今發(fā)現(xiàn)的第一個具有磷酸酶活性的抑癌基因，對細胞的生長、增殖、分化、凋亡、黏附、遷移和血管生長等許多生物學(xué)行為有重要影響。隨著研究的深入人們也發(fā)現(xiàn)其在非腫瘤性疾病，如：心肌肥大，高血壓動脈粥樣硬化，支氣管哮喘哮等疾病中也發(fā)揮重要的作用。 已有的研究已經(jīng)證實PTEN可以通過對P13K，ERK和FAK等通路的抑制來抑制腫瘤細胞，心肌和血管平滑肌等細胞的增殖，而這些通路同時也是介導(dǎo)ASMC增

4、殖，遷移等的主要信號傳導(dǎo)通路，PTEN對ASMC的增殖等是否也有類似地影響，目前尚無相關(guān)的報道。我們推斷PTEN的過表達對HASMC可能也具有類似的抑制增殖作用。 二.研究目的： 通過攜帶野生型PTEN全長cDNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的人氣道平滑肌細胞(HumanAirwaySmoothMuscleCell，HASMC)，實現(xiàn)PTEN的過表達，以空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和正常組作為對照，初步研究PTEN的過表達對HASMC增殖和細胞周期

5、進展的影響。 三.材料和方法： 1、分離肺癌肺葉切除術(shù)患者切除的相對正常的肺組織中的小支氣管，按照本實驗室已經(jīng)成熟的方法培養(yǎng)人氣道平滑肌細胞，4～8代的氣道平滑肌細胞用于實驗。用抗平滑肌a-肌動蛋白單克隆抗體鑒定為人氣道平滑肌細胞。 2、攜帶野生型PTENcDNA的質(zhì)粒(p-WT-PTEN)和空載質(zhì)粒(p-EGFP)轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌DH5a中擴增。氨芐青霉素篩選，挑選陽性克隆，搖菌，Omega公司無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取

6、試劑盒提取質(zhì)粒，雙酶切，及基因測序鑒定正確后，大量提取質(zhì)粒，-20℃保存?zhèn)溆谩?3、實驗分組：將細胞分為3組：轉(zhuǎn)染p-WT-PTEN質(zhì)粒組(A組)、轉(zhuǎn)染空載體p-EGFP組(B組)、正常對照組(C組)。參照Lipofectamin2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒步驟進行操作，倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果。 4、MTS/PMS微量比色法檢測各組HASMC的增殖。 5、各組細胞PI單染后流式細胞儀測定細胞周期分布。 6

7、、Trizol提取總RNA，RT-PCR檢測各組細胞PTENmRNA的表達。 7、免疫組化SP法檢測轉(zhuǎn)染后各組HASMCPTEN蛋白的表達并拍照。 8、所有原始數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，應(yīng)用SPSS11.5軟件進行OneWayANOVA(LSD)統(tǒng)計學(xué)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 四.結(jié)果： 1、ASMC未匯合之前多呈梭形或多邊形，內(nèi)有1-2個細胞核，可向細胞密度低的方向伸出一至數(shù)個足突。細胞匯合

8、后部分區(qū)域細胞束狀排列，呈典型“峰谷”狀。對平滑肌細胞特異的a-肌動蛋白進行免疫細胞化學(xué)染色，免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物呈棕黃色。傳至第4代，平滑肌純度為95％。 2、少量制備的質(zhì)粒，經(jīng)XbaⅠ和HindⅢ酶切后，瓊脂糖凝膠電泳，可顯示兩條條帶，分子量分別為5.4kb、1.3kb，與pGZdXZ和插入的PTEN基因的大小一致。提取的質(zhì)粒送北京諾賽公司測序，測序結(jié)果經(jīng)BLAST與Genebank序列完全相符。 3、倒置熒光顯微鏡下，

9、見質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染ASMC，轉(zhuǎn)染陽性細胞在熒光顯微鏡下發(fā)綠色熒光。 4、MTS/PMS法檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對HASMCs增殖的影響，結(jié)果顯示p-WT-PTEN轉(zhuǎn)染組細胞的吸光度(OD490值)顯著低于p-EGFP轉(zhuǎn)染組和對照組(P<0.05)；而p-EGFP轉(zhuǎn)染組與對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。 5、流式細胞儀檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對HASMCs細胞周期的影響，p-WT-PTEN轉(zhuǎn)染組G0/G1期細胞的比例顯著大于空載體轉(zhuǎn)染組與

10、未轉(zhuǎn)染組，S期及G2/M期細胞的比例顯著少于p-EGFP轉(zhuǎn)染組與對照組(P<0.05)，p-EGFP轉(zhuǎn)染組與對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。 6、RT-PCR同時擴增p-WT-PTEN轉(zhuǎn)染組，p-EGFP轉(zhuǎn)染組和對照組PTENmRNA，結(jié)果顯示p-WT-PTEN轉(zhuǎn)染組PTENmRNA的表達顯著比p-EGFP轉(zhuǎn)染組及對照組PTENmRNA的表達增加。 7、轉(zhuǎn)染48小時各組HASMCPTEN蛋白免疫組化結(jié)果顯示，P

11、TEN蛋白在p-WT-PTEN轉(zhuǎn)染陽性HASMC胞漿和胞核均有明顯表達，且胞核表達比胞漿多，而p-EGFP轉(zhuǎn)染組和對照組僅見微弱的PTEN蛋白表達。 五.結(jié)論： 1、PTEN在HASMC中具有與在其他細胞中類似的抑制增殖的作用，外源PTEN的表達能夠抑制HASMC的增殖和細胞周期進展，G0/G1期細胞的比例增大，而S期及G2/M期細胞的比例減少。 2、p-WT-PTEN成功轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)地HASMC后，PTEN在m