木材煙霧凝集物對(duì)人氣道平滑肌細(xì)胞作用的初步研究.pdf

1、【研究背景】
　　我們的前期流行病學(xué)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn),生物燃料暴露也是導(dǎo)致慢性阻塞性肺疾病(簡(jiǎn)稱:慢阻肺)的重要危險(xiǎn)因素之一。近年來發(fā)現(xiàn),氣道平滑肌細(xì)胞作為氣道的主要結(jié)構(gòu)細(xì)胞之一,不僅可以通過細(xì)胞數(shù)目增多、體積增大來參與氣道壁增厚,而且在外界因素,如炎癥介質(zhì)、氧化因子等的刺激下,還發(fā)揮自分泌和旁分泌功能,影響周圍的結(jié)構(gòu)細(xì)胞和炎癥細(xì)胞。氣道平滑肌層的增厚是氣道重塑的重要病理改變,上皮下基質(zhì)增多、上皮下纖維化也參與了慢阻肺氣道的重塑。氣道

2、平滑肌細(xì)胞的增殖與凋亡、甚至由壞死而引起的強(qiáng)烈炎癥反應(yīng)共同參與了氣道的損傷與修復(fù),最終引起氣道結(jié)構(gòu)的不可逆重塑。初步研究體外暴露生物燃料凝集物對(duì)氣道平滑肌細(xì)胞的效應(yīng)如何,對(duì)進(jìn)一步明確生物燃料致慢阻肺機(jī)制的基礎(chǔ)研究有重要指導(dǎo)意義。
　　【目的】
　　通過細(xì)胞增殖檢測(cè)技術(shù)觀察特定濃度木材煙霧凝集物(WSC)處理后的人氣道平滑肌細(xì)胞的增殖效應(yīng),并利用Q-PCR和Western blot檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白1(cyclin D1)的含量

3、變化,分析影響細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。通過觀察細(xì)胞形態(tài)和數(shù)目變化,膜聯(lián)蛋白-Ⅴ(Annexin-Ⅴ)和碘化丙啶(PI)凋亡和壞死檢測(cè)技術(shù),觀察WSC處理后人氣道平滑肌細(xì)胞的壞死和凋亡效應(yīng)。
　　【方法】
　　一、購買的原代人氣道平滑肌細(xì)胞復(fù)蘇傳代培養(yǎng),2-8代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組:空白對(duì)照組、WSC刺激組、CSC刺激組,WSC和CSC的刺激濃度經(jīng)CCK8細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)初步確定細(xì)胞活力增殖范圍,以及細(xì)胞增殖抑制初始濃度。
　

4、　二、WSC對(duì)HASMCS增殖效應(yīng)的影響:細(xì)胞培養(yǎng)和處理24小時(shí)后,EDU實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期檢測(cè)細(xì)胞增殖效應(yīng);Q-PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞cyclinD1的含量變化。
　　三、WSC對(duì)HASMCS壞死和凋亡的影響:不同濃度的凝集物刺激下,光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化,細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)目。細(xì)胞早期凋亡和壞死鑒別試劑膜聯(lián)蛋白-Ⅴ(Annexin-Ⅴ)和碘化丙啶(PI),貼壁共染細(xì)胞,熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)

5、凋亡和壞死細(xì)胞比例。
　　【結(jié)果】
　　一、在WSC1μg/ml、CSC10μg/ml時(shí),細(xì)胞活性分別為[(126±12)％、(142±11)%],較空白對(duì)照組[(100±0)%]明顯增加,此時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞活性增殖峰,q值分別為9.33和6.24,P<0.05。暴露劑量達(dá)到WSC10μg/ml、CSC60μg/ml時(shí),細(xì)胞活性被抑制,分別為85.67%、75.85%,較空白對(duì)照組顯著降低,q值分別為5.19和3.63,P<0.0

6、5。
　　二、WSC1μg/ml刺激組細(xì)胞增殖指標(biāo)中的細(xì)胞增殖比例和cyclin D1蛋白灰度相對(duì)值[(123±20)%,1.31±0.64]顯著高于空白對(duì)照[(100±0)%,1.0±0.0],q值分別為5.85和5.91,P<0.05;而S+G2M期細(xì)胞比例和cyclin D1 mRNA表達(dá)量[(102±4)%、1.18±0.21]較未處理組[(100±0%),1.0±0.0]無顯著差異,P值均>0.05。CSC10μg/ml

7、組的細(xì)胞增殖比例、S+G2M期比例、cyclinD1mRNA和蛋白灰度分別為[(204±45)%、(140±6)%、1.48±0.27和1.80±0.25],均顯著大于對(duì)照組,q值分別為11.87、16.51、5.38和15.06,同時(shí)也高于WSC1μg/ml組,q值分別為9.41、15.35、3.33和9.15,P值均<0.05。
　　三、WSC10μg/ml刺激時(shí),壞死細(xì)胞比例增加為[(13.39±0.15)%],高于空白對(duì)照

8、組[(1.57±0.41)%]和CSC60μg/ml組[(6.61±1.91)%],q值分別為18.03和10.34,P<0.05;而CSC40μg/ml刺激時(shí),凋亡細(xì)胞比例增多為[(61.8±10.6)%],高于空白對(duì)照組[(0.0±0.0)%]和WSC10μg/ml組[(1.7±0.4)%],q值分別為17.44和16.95,P均<0.05。
　　【結(jié)論】
　　體外暴露木材煙霧凝集物對(duì)氣道平滑肌細(xì)胞的作用效應(yīng)與體外暴露于