Rho激酶信號(hào)通路在Endothelin-1誘導(dǎo)的人氣道平滑肌細(xì)胞遷移和細(xì)胞骨架變化中的作用.pdf

1、研究背景及目的： 支氣管哮喘(Bronchialasthma，asthma)是一種氣道慢性炎癥性、過(guò)敏性疾病，氣道重塑(Airwayremodeling)是慢性支氣管哮喘重要病理學(xué)特征，主要表現(xiàn)為氣道基底膜增厚和上皮下纖維化、氣道平滑肌的肥厚、增殖、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的沉積，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和腺體增生肥大等等。而作為氣道中數(shù)目和體積最大的細(xì)胞：氣道平滑肌細(xì)胞(Airwaysmoothmusclecell，ASMC)，在哮喘氣道重塑中發(fā)揮

2、重要的作用，被認(rèn)為是哮喘氣道重塑的關(guān)鍵細(xì)胞。ASMC的收縮、增殖、肥大、分泌細(xì)胞外基質(zhì)蛋白等促進(jìn)氣道重塑的發(fā)生發(fā)展，并進(jìn)一步加重氣道高反應(yīng)性(AirwayHyperreactivity，AHR)。 近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，ASMC也具有遷移的功能，這種遷移與動(dòng)脈粥樣硬化時(shí)血管平滑肌細(xì)胞(Vascularsmoothmusclecell，VSMC)的遷移相類似，因此可以推測(cè)：哮喘時(shí)ASMC在細(xì)胞外基質(zhì)的影響和各種細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)和生長(zhǎng)

3、因子的聯(lián)合作用下，ASMC向氣道內(nèi)膜定向移動(dòng)并發(fā)生增殖，導(dǎo)致氣道壁的增厚和狹窄，雖然目前還缺乏ASMC向氣道內(nèi)膜直接遷移的證據(jù)，但有研究發(fā)現(xiàn)，在哮喘患者氣道活檢組織標(biāo)本中，氣道固有層內(nèi)發(fā)現(xiàn)的肌纖維母細(xì)胞在顯微結(jié)構(gòu)、形態(tài)學(xué)和位置方面都與ASMC極其相似，提示肌纖維母細(xì)胞可能是ASMC遷移并轉(zhuǎn)化而來(lái)，ASMC的遷移的研究是近來(lái)的熱點(diǎn)之一，但對(duì)于ASMC遷移的機(jī)制目前還不十分清楚。 目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)包括PDGF、IL-

4、1β、尿激酶、半胱氨酸白三烯、LPA等能夠趨化ASMC的遷移，而作為哮喘時(shí)氣道內(nèi)一種重要的炎癥介質(zhì)，內(nèi)皮素-1(Endothelin-1，ET-1)是目前已知的收縮支氣管最強(qiáng)烈的物質(zhì)之一，哮喘時(shí)氣道上皮損傷后表達(dá)增多，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它能誘導(dǎo)許多類型的細(xì)胞例如嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)、血管平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、表皮黑素細(xì)胞等遷移，但ET-1能否誘導(dǎo)ASMC的趨化遷移，目前還缺乏相關(guān)研究。 Rho/Rho激酶信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要

5、的信號(hào)通路，Rho激酶(ROCK)是該通路的關(guān)鍵分子，越來(lái)越多的證據(jù)表明該通路參與了哮喘時(shí)氣道高反應(yīng)性(AHR)的形成、EOS向BALF聚集、氣道重塑等多種病理生理過(guò)程，但該通路在ASMC遷移中報(bào)道甚少。因此，本實(shí)驗(yàn)主要對(duì)以下兩個(gè)方面進(jìn)行研究：一)研究ET-1對(duì)ASMC的誘導(dǎo)遷移作用。二)初步探討Rho激酶信號(hào)通路在ASMC遷移中的作用。 材料與方法： 1、經(jīng)患者同意，取南方醫(yī)院胸外科同期做肺葉切除術(shù)患者的正常肺葉、段支

6、氣管標(biāo)本。 2、組織塊貼壁法培養(yǎng)人支氣管平滑肌細(xì)胞(Airwaysmoothmusclecell，ASMC)，光鏡下觀察和細(xì)胞免疫組化進(jìn)行ASMC鑒定。 3、使用改良的boydenchamber小室檢測(cè)不同濃度ET-1作用下ASMC的跨膜遷移能力的變化，5ng/ml的PDGF作為陽(yáng)性對(duì)照。 4、不同濃度的Rho激酶特異抑制劑Y-27632阻斷Rho激酶信號(hào)通路，觀察該信號(hào)通路在ET-1誘導(dǎo)的ASMC遷移中的作用。

7、 5、FITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽標(biāo)記F-肌動(dòng)蛋白骨架，激光共聚焦掃描顯微鏡觀察ASMC細(xì)胞骨架的變化。 6、Westernblot檢測(cè)ET-1作用不同時(shí)間Rho激酶信號(hào)通路下游底物肌球蛋白磷酸酶目標(biāo)亞單位1(myosin-phosphatasetarget1,MYPT1)的磷酸化水平，以反應(yīng)Rho激酶信號(hào)通路的活化狀況。 7、采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行結(jié)果分析，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±S)表示，組間比較用

8、one-wayANOVA分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1、ASMC的形態(tài)及免疫組化鑒定：倒置顯微鏡下單個(gè)ASMC呈長(zhǎng)梭形，貼壁生長(zhǎng)至融合后，細(xì)胞呈現(xiàn)出特征的“峰谷”狀形態(tài)。細(xì)胞免疫組化平滑肌細(xì)胞表型標(biāo)志物a-actin鑒定，光鏡下可見細(xì)胞漿中較多棕黃色顆粒為染色陽(yáng)性細(xì)胞。 2、ET-1在0.1、1、10、100nmol/L濃度有誘導(dǎo)ASMC跨膜遷移的作用，遷移細(xì)胞數(shù)目分別為(25.2±1.56)

9、、(36.03±2.94)、(49.80±4.47)、(37.96±3.59)個(gè)，ET-1濃度在10nmol/L趨化ASMC跨膜遷移能力最強(qiáng)，與對(duì)照組(19.08±2.06)個(gè)相比，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。5ng/ml的PDGF能顯著誘導(dǎo)ASMC遷移(87.73±6.14)個(gè)，與對(duì)照組(19.08±2.06)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 3、Rho激酶抑制劑Y-27632呈濃度依賴性抑制ET-1(10n

10、mol/L)誘導(dǎo)的ASMC跨膜遷移，且隨著其濃度的增加，抑制作用越明顯，Y-27632濃度為0.4/μmol/L、2μmol/L、10μmol/L時(shí)遷移細(xì)胞數(shù)目分別為(44.26±2.50)、(34.56±1.67)、(20.93±1.84)個(gè)，其中Y-27632濃度10μmol/L時(shí)顯著抑制ASMC的跨膜遷移，與Y27632(0μmol/L)組(48.30±2.64)個(gè)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 4、激光共聚焦觀

11、察細(xì)胞骨架：空白對(duì)照組細(xì)胞有少量短而細(xì)的應(yīng)力纖維，無(wú)絲狀偽足形成。ET-1(10nmol/L)刺激30min細(xì)胞即發(fā)生伸展，應(yīng)力纖維形成增多；加入Rho激酶特異抑制劑Y-27632(10μmol/L)預(yù)處理后，細(xì)胞輪廓變細(xì)，偽足及應(yīng)力纖維少見。 5、westernblot：ET-1(10nmol/L)處理15min、30min、1h、2h、6h、12h、24h后，磷酸化MYPT1(p-MYPT1)蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為：0.68

12、±0.04、0.66±0.10、0.44±0.06、0.48±0.14、0.43±0.13、0.39±0.10、0.28±0.05。與空白組(0.37±0.03)相比，ET-1處理15min、30min后p-MYPT1表達(dá)水平顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)：隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，p-MYPT1表達(dá)程度減弱，與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 結(jié)論： ET-1能夠激活Rho激酶信號(hào)通路，且在一定濃度范圍