腫瘤抑制基因PTEN對人氣道平滑肌細胞凋亡和細胞周期的影響.pdf

1、研究背景:支氣管哮喘(Bronchial asthma,asthma)是一種由嗜酸性粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞等炎癥細胞、氣道上皮細胞和細胞組分所介導的具有復雜免疫機制的氣道慢性過敏反應炎癥性疾病。主要表現(xiàn)為氣道內嗜酸性粒細胞浸潤、粘液分泌增多以及對外來吸入性過敏原和非特異性刺激的氣道反應性增高。哮喘時氣流阻塞可為可逆、部分不可逆甚至完全不可逆,導致臨床表現(xiàn)復雜多變,增加了治療的難度,并影響疾病的轉歸。目前有效的抗炎治療并不能根治哮喘

2、,不能完全消除氣道高反應性,因此在氣道炎癥和氣道高反應性之間存在著一個明顯的“關聯(lián)缺失”。作為哮喘的一個關鍵基本特征-氣道重塑,它將哮喘氣道炎癥和氣道高反應性聯(lián)系在一起。氣道重塑指的是哮喘時發(fā)生在氣道壁的結構改變,這些改變包括氣道壁增厚,上皮損傷和上皮細胞增生,上皮下纖維化,杯狀細胞化生和粘液轉化,肌纖維母細胞增生和肌細胞增生與肥大,血管異常,基質蛋白沉積及腺體增生肥大等。作為氣道重塑主要結構成分之一-氣道平滑肌細胞(airway sm

3、ooth muscle cell,ASMC)的地位越來越得到重視。ASMC不僅是氣道炎癥損傷的靶細胞,而且作為效應細胞主動參與了哮喘的病理過程(氣道炎癥、氣道重塑和氣道高反應性)和病情的加重。目前普遍認為ASMC的增生過度和凋亡減少在哮喘氣道重塑中占有十分重要的地位。遺憾的是,現(xiàn)今的哮喘診治方案,均強調吸入糖皮質激素對氣道炎癥的控制,而對哮喘氣道重塑重視不夠,且現(xiàn)行的治療方法尚不能有效的阻止甚至逆轉氣道重塑的發(fā)生和發(fā)展。正因為如此,近年

4、來ASMC已成為哮喘研究的一個新熱點,越來越多的研究學者提出應把ASMC作為支氣管哮喘研究和治療的標靶。所以,進一步揭示ASMC參與哮喘的相關機制,對開辟哮喘治療的新思路具有重要意義。
　　 10號染色體上磷酸酶與張力蛋白同源缺失性基因PTEN(phosphase andtensin homology deleted on chromosome ten,PTEN)亦稱MMAC1基因(mutatedin multiply adva

5、nced cancer1,多種晚期癌癥中發(fā)生突變的基因,或者多發(fā)性進展期癌癥突變基因)或TEP-1基因(TGF-β1 regulated and epithelial cell-richedphosphatase1,由TGF-β1調控并在上皮細胞中高度表達的磷酸酶),定位于10q23.3,全長200 kb,是1997年由3個小組發(fā)現(xiàn)的第一個既具有抑癌功能,又具有磷酸酶活性的腫瘤抑制基因,在胚胎的發(fā)育、細胞增殖和凋亡、細胞周期的調節(jié)、遷移

6、(侵襲)和細胞骨架等方面起著重要的調控作用。已有的研究發(fā)現(xiàn)在人類多種腫瘤中,如前列腺癌、膠質瘤、乳腺癌、子宮內膜癌和卵巢癌等,都存在PTEN基因表達的改變。隨著研究的深入,人們也發(fā)現(xiàn)PTEN基因在非腫瘤性疾病,如:心肌肥大、高血壓動脈粥樣硬化、支氣管哮喘、腎纖維化以及缺血性腦中風等疾病中也發(fā)揮了重要的作用。PTEN基因能夠編碼由403個氨基酸組成的蛋白質-PTEN蛋白,其屬于蛋白酪氨酸磷酸酶家族成員,是一個雙重特異性蛋白磷酸酶,調節(jié)酪氨

7、酸磷酸酶和絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶介導的信號轉導,在維持正常細胞的穩(wěn)定性中發(fā)揮著重要的作用。PTEN蛋白可能通過其脂質磷酸酶/蛋白磷酸酶活性直接或間接地的調節(jié)了復雜的信號網(wǎng)絡系統(tǒng)而發(fā)揮作用。PTEN蛋白可以調控磷脂酰肌醇-3-激酶信號傳導通路(PI3K/PKB/Akt信號級聯(lián))、絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信號傳導通路(Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2信號級聯(lián)),同時PTEN還能特異性的誘導細胞周期素依賴性激酶抑制因子p21、

8、p27等的表達增加,下調細胞周期蛋白CyclinD1的表達,而上述這些信號分子同時也是介導ASMC生長、生存功能的主要信號分子。鑒于既往的研究顯示,PTEN能通過調節(jié)PI3K/Akt、MAPK和細胞周期相關蛋白的表達來影響腫瘤細胞、血管平滑肌細胞和成纖維細胞的生長和生存,我們推論PTEN對ASMC也有相似的作用。所以,進一步深入的研究PTEN對PI3K/PKB/Akt、MAPK及其下游的信號分子、細胞周期素依賴性激酶抑制因子和細胞周期蛋

9、白等相關的信號傳導分子的影響,從而初步闡明PTEN調控ASMC生長、生存的機制,期望能為PTEN參與哮喘的氣道重塑提供理論和實驗的依據(jù)。
　　 研究目的:通過將攜帶野生型PTEN cDNA的腺病毒載體(Ad-PTEN-GFP)轉染體外培養(yǎng)的人氣道平滑肌細胞(Airway Smooth Muscle Cell,ASMC),實現(xiàn)PTEN基因的過表達,并以僅攜帶綠色熒光蛋白GFP的陰性對照腺病毒(Ad-GFP)轉染組和只添加無血清培養(yǎng)

10、基DMEM的空白組作為對照,初步研究PTEN基因對ASMC凋亡和細胞周期相關信號分子通路的影響。
　　 材料和方法
　　 1.人氣道平滑肌細胞(ASMC)的分離、培養(yǎng)與鑒定:分離肺葉切除術患者切除的相對正常肺葉、肺段支氣管標本,按照相關文獻報道和本課題小組已經(jīng)成熟的方法,采用組織塊貼壁培養(yǎng)法進行人氣道平滑肌細胞的培養(yǎng),取3～8代的氣道平滑肌細胞用于實驗。在倒置顯微鏡下觀察細胞生長和形態(tài),并用抗平滑肌α-肌動蛋白單克隆抗體

11、(α-SM actin)行免疫細胞化學染色鑒定為人氣道平滑肌細胞。
　　 2.實驗分組:將實驗細胞分為以下3組:①過表達PTEN組(Ad-PTEN):應用腺病毒載體攜帶野生型PTEN基因以最佳感染復數(shù)(multiplicity of infection,MOI)=100體外轉染ASMCs;②陰性對照組(Ad-GFP):應用腺病毒空載體攜帶綠色熒光蛋白GFP以感染復數(shù)=100體外轉染ASMCs;③空白對照組(DMEM):只添加無血

12、清培養(yǎng)基DMEM體外培養(yǎng)ASMCs。
　　 3.重組腺病毒感染ASMCs:選擇處于對數(shù)生長期的ASMCs,加入用無血清的DMEM稀釋的病毒液,置于37℃、飽和濕度、5％CO2培養(yǎng)箱中孵育,6-8 h后補加含有血清的完全培養(yǎng)基,繼續(xù)孵育24h后,更換完全培養(yǎng)基,通過在倒置熒光顯微鏡下和流式細胞術檢測觀察病毒轉染效果。
　　 4.CCK-8法檢測病毒轉染后的細胞毒性和3組氣道平滑肌細胞的生長狀況。
　　 5.Hoec

13、hst-33342染色觀察3組氣道平滑肌細胞凋亡情況。
　　 6.PE-7AAD雙標流式細胞術檢測3組氣道平滑肌細胞凋亡情況。
　　 7.PI單染后流式細胞術檢測3組氣道平滑肌細胞各自的細胞周期分布情況。
　　 8.Western blotting免疫印跡法檢測四組氣道平滑肌細胞的PTEN、p-Akt、total—Akt、p-ERK1/2、total—ERK1/2、cleaved-Caspases-3、Caspa

14、ses-9、p21、CyclinD1蛋白以及內參β—actin的表達。
　　 9.所有原始數(shù)據(jù)用(x)±s表示,用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析。兩組均數(shù)比較采用t檢驗。多重比較采用One Way ANOVA分析,組間比較采用LSD/Bonferroni法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果
　　 1.倒置顯微鏡在×100倍鏡下觀察,ASMCs未匯合之前多呈梭形或多邊形,細胞匯合后部分區(qū)域的細胞成束狀

15、排列,呈典型“峰與谷”狀。對平滑肌細胞特異的α-肌動蛋白(α-SM actin)進行免疫細胞化學染色,在×400高倍鏡下可見α-SM actin在氣道平滑肌細胞胞漿內均勻分布,呈棕色平行纖維絲狀結構。傳至第3-4代,平滑肌細胞純度為95％。
　　 2.Ad-GFP轉染人ASMCs1d后可在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光,表明重組腺病毒載體成功轉染ASMC。轉染2d后熒光顯微鏡低倍鏡下滿視野皆可見轉染陽性的平滑肌細胞呈現(xiàn)明顯綠色熒光。

16、MOI=100轉染2d后,熒光顯微鏡觀察下顯示轉染效率達(95.19±0.39)％,流式細胞檢測顯示轉染效率可達(96.20±0.33)％。
　　 3.CCK-8法檢測3組氣道平滑肌細胞的生長狀況和細胞毒性:轉染腺病毒載體Ad-PTEN組、Ad-GFP組、空白對照組細胞第1、2、3天450 nm處吸光度值有統(tǒng)計學差異(F=480.63、106.644、89.592,P=0.000),Ad-PTEN組吸光度值明顯低于Ad-GFP組

17、和空白對照組(P<0.05),表明Ad—PTEN組細胞的增殖低于陰性對照和空白對照組；進一步檢測Ad—GFP組和空白對照組對細胞的生長和毒性情況,發(fā)現(xiàn)兩組第1、2、3天在450 nm處吸光度值無統(tǒng)計學差異(t=-0.327、1.149、-1.732,P=0.748、0.270、O.105),表明空載病毒對細胞的生長無影響且無細胞毒性。
　　 4.Hoechst-33342染色觀察3組氣道平滑肌細胞凋亡情況:轉染腺病毒Ad-PTE

18、N組、Ad—GFP組和空白對照組第2、3、5、7天所測得的細胞凋亡率相比較,差異無統(tǒng)計學意義(F值=1.650、0.412、0.085,P=0.245,0.674,0.919)。表明轉染PTEN基因并不能誘導正常的ASMCs產(chǎn)生凋亡。
　　 5.PE-7AAD雙標流式細胞術檢測3組氣道平滑肌細胞凋亡情況:轉染腺病毒載體Ad-PTEN、Ad-GFP組和空白對照組第2、3、5、7天PE-7AAD雙標流式細胞術檢測,3組的凋亡率無明顯

19、統(tǒng)計學差異(F=1.988、2.569、0.127、0.064,P=0.191,0.131,0.882、0.939),也同時證明表明轉染PTEN基因并不能誘導正常的ASMCs產(chǎn)生凋亡。
　　 6.Western blotting免疫印跡法檢測PTEN蛋白的表達:成功轉染腺病毒載體Ad-PTEN后,過表達PTEN基因組細胞的PTEN蛋白表達增強；而Ad-GFP組和空白對照組PTEN蛋白的表達無明顯變化。
　　 7.West

20、ern blotting免疫印跡法檢測Akt蛋白的表達:轉染腺病毒載體Ad-PTEN后,過表達PTEN基因組細胞的p-Akt表達顯著減少,但3組細胞的total-Akt表達無明顯差異。
　　 8.Western blotting免疫印跡法檢測ERK1/2蛋白的表達:轉染腺病毒載體Ad-PTEN后,p-ERK1/2和total-Akt的表達與Ad—GFP組和空白對照組相比較無明顯差異。
　　 9.Western blott

21、ing免疫印跡法檢測cleaved—Caspases-3、Caspases-9蛋白的表達:轉染腺病毒載體Ad-PTEN與Ad-GFP組和空白對照組相比較,3組的cleaved-Caspases-3、Caspases-9蛋白表達無明顯差異。
　　 10.PI單染的流式細胞術細胞周期檢測結果:轉染腺病毒載體Ad-PTEN48h后,G0-G1期細胞增多,S期細胞和G2/M期細胞則減少。Ad-PTEN組、Ad-GFP組、空白對照組細胞G

22、0/G1期相比較,差異均有統(tǒng)計學意義(F=8.333,P=0.005)。Ad-PTEN組G0/G1期細胞與Ad-GFP組、空白對照組相比有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。表明轉染Ad-PTEN能阻滯細胞在G0/G1期。
　　 11.Western blotting免疫印跡法檢測p21蛋白的表達:轉染腺病毒載體Ad-PTEN組與Ad-GFP組和空白對照組相比較,p21蛋白的表達明顯上調,而Ad-GFP組和空白對照組相比較表達無明顯差異

23、。
　　 12.Western blotting免疫印跡法檢測CyclinD1蛋白的表達,轉染腺病毒載體Ad-PTEN組與Ad-GFP組和空白對照組相比較,CyclinD1蛋白的表達明顯下調,而Ad-GFP組和空白對照組相比較表達無明顯差異。
　　 結論:本研究通過采用基因過表達技術,研究了過表達腫瘤抑制基因PTEN對氣道平滑肌細胞(ASMC)凋亡和細胞周期的影響,并初步探討了p-Akt、total-Akt、p-ERK1

24、/2、total-ERK1/2、cleaved-Caspases-3、Caspases-9、p21、CyclinD1等信號分子的變化情況,通過上述研究我們得到了以下結論:
　　 1.腺病毒介導的表達系統(tǒng)能高效瞬時的在體外轉染ASMC。其轉染ASMC的效率可以達到95％左右。轉染后對細胞無毒性,是一種安全的基因載體。
　　 2.PTEN基因的過表達不能誘導ASMC產(chǎn)生凋亡效應。Hoechst-33342染色、PE-7AAD

25、雙標流式細胞技術和免疫印跡cleaved-Caspases-3、Caspases-9蛋白的表達均證實了這點。此結果與PTEN基因能誘導某些類型的細胞凋亡的結論不同。
　　 3.PTEN基因的過表達能夠抑制ASMC的增殖和細胞周期進展,G0-G1期細胞的比例增多,而S期和G2/M期細胞的比例減少。這與PTEN作用于其他類型的細胞的結果相似。
　　 4.過表達PTEN基因能下調p-Akt調節(jié)細胞增殖而對p-ERK1/2、to