腫瘤抑制基因PTEN對(duì)人氣道平滑肌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響.pdf

1、研究背景:支氣管哮喘(Bronchial asthma,asthma)是一種由嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞和細(xì)胞組分所介導(dǎo)的具有復(fù)雜免疫機(jī)制的氣道慢性過(guò)敏反應(yīng)炎癥性疾病。主要表現(xiàn)為氣道內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、粘液分泌增多以及對(duì)外來(lái)吸入性過(guò)敏原和非特異性刺激的氣道反應(yīng)性增高。哮喘時(shí)氣流阻塞可為可逆、部分不可逆甚至完全不可逆,導(dǎo)致臨床表現(xiàn)復(fù)雜多變,增加了治療的難度,并影響疾病的轉(zhuǎn)歸。目前有效的抗炎治療并不能根治哮喘

2、,不能完全消除氣道高反應(yīng)性,因此在氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性之間存在著一個(gè)明顯的“關(guān)聯(lián)缺失”。作為哮喘的一個(gè)關(guān)鍵基本特征-氣道重塑,它將哮喘氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性聯(lián)系在一起。氣道重塑指的是哮喘時(shí)發(fā)生在氣道壁的結(jié)構(gòu)改變,這些改變包括氣道壁增厚,上皮損傷和上皮細(xì)胞增生,上皮下纖維化,杯狀細(xì)胞化生和粘液轉(zhuǎn)化,肌纖維母細(xì)胞增生和肌細(xì)胞增生與肥大,血管異常,基質(zhì)蛋白沉積及腺體增生肥大等。作為氣道重塑主要結(jié)構(gòu)成分之一-氣道平滑肌細(xì)胞(airway sm

3、ooth muscle cell,ASMC)的地位越來(lái)越得到重視。ASMC不僅是氣道炎癥損傷的靶細(xì)胞,而且作為效應(yīng)細(xì)胞主動(dòng)參與了哮喘的病理過(guò)程(氣道炎癥、氣道重塑和氣道高反應(yīng)性)和病情的加重。目前普遍認(rèn)為ASMC的增生過(guò)度和凋亡減少在哮喘氣道重塑中占有十分重要的地位。遺憾的是,現(xiàn)今的哮喘診治方案,均強(qiáng)調(diào)吸入糖皮質(zhì)激素對(duì)氣道炎癥的控制,而對(duì)哮喘氣道重塑重視不夠,且現(xiàn)行的治療方法尚不能有效的阻止甚至逆轉(zhuǎn)氣道重塑的發(fā)生和發(fā)展。正因?yàn)槿绱?近年

4、來(lái)ASMC已成為哮喘研究的一個(gè)新熱點(diǎn),越來(lái)越多的研究學(xué)者提出應(yīng)把ASMC作為支氣管哮喘研究和治療的標(biāo)靶。所以,進(jìn)一步揭示ASMC參與哮喘的相關(guān)機(jī)制,對(duì)開辟哮喘治療的新思路具有重要意義。
　　 10號(hào)染色體上磷酸酶與張力蛋白同源缺失性基因PTEN(phosphase andtensin homology deleted on chromosome ten,PTEN)亦稱MMAC1基因(mutatedin multiply adva

5、nced cancer1,多種晚期癌癥中發(fā)生突變的基因,或者多發(fā)性進(jìn)展期癌癥突變基因)或TEP-1基因(TGF-β1 regulated and epithelial cell-richedphosphatase1,由TGF-β1調(diào)控并在上皮細(xì)胞中高度表達(dá)的磷酸酶),定位于10q23.3,全長(zhǎng)200 kb,是1997年由3個(gè)小組發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)既具有抑癌功能,又具有磷酸酶活性的腫瘤抑制基因,在胚胎的發(fā)育、細(xì)胞增殖和凋亡、細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)、遷移

6、(侵襲)和細(xì)胞骨架等方面起著重要的調(diào)控作用。已有的研究發(fā)現(xiàn)在人類多種腫瘤中,如前列腺癌、膠質(zhì)瘤、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌等,都存在PTEN基因表達(dá)的改變。隨著研究的深入,人們也發(fā)現(xiàn)PTEN基因在非腫瘤性疾病,如:心肌肥大、高血壓動(dòng)脈粥樣硬化、支氣管哮喘、腎纖維化以及缺血性腦中風(fēng)等疾病中也發(fā)揮了重要的作用。PTEN基因能夠編碼由403個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)-PTEN蛋白,其屬于蛋白酪氨酸磷酸酶家族成員,是一個(gè)雙重特異性蛋白磷酸酶,調(diào)節(jié)酪氨

7、酸磷酸酶和絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),在維持正常細(xì)胞的穩(wěn)定性中發(fā)揮著重要的作用。PTEN蛋白可能通過(guò)其脂質(zhì)磷酸酶/蛋白磷酸酶活性直接或間接地的調(diào)節(jié)了復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)而發(fā)揮作用。PTEN蛋白可以調(diào)控磷脂酰肌醇-3-激酶信號(hào)傳導(dǎo)通路(PI3K/PKB/Akt信號(hào)級(jí)聯(lián))、絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信號(hào)傳導(dǎo)通路(Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2信號(hào)級(jí)聯(lián)),同時(shí)PTEN還能特異性的誘導(dǎo)細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制因子p21、

8、p27等的表達(dá)增加,下調(diào)細(xì)胞周期蛋白CyclinD1的表達(dá),而上述這些信號(hào)分子同時(shí)也是介導(dǎo)ASMC生長(zhǎng)、生存功能的主要信號(hào)分子。鑒于既往的研究顯示,PTEN能通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/Akt、MAPK和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)來(lái)影響腫瘤細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)和生存,我們推論P(yáng)TEN對(duì)ASMC也有相似的作用。所以,進(jìn)一步深入的研究PTEN對(duì)PI3K/PKB/Akt、MAPK及其下游的信號(hào)分子、細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制因子和細(xì)胞周期蛋

9、白等相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)分子的影響,從而初步闡明PTEN調(diào)控ASMC生長(zhǎng)、生存的機(jī)制,期望能為PTEN參與哮喘的氣道重塑提供理論和實(shí)驗(yàn)的依據(jù)。
　　 研究目的:通過(guò)將攜帶野生型PTEN cDNA的腺病毒載體(Ad-PTEN-GFP)轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的人氣道平滑肌細(xì)胞(Airway Smooth Muscle Cell,ASMC),實(shí)現(xiàn)PTEN基因的過(guò)表達(dá),并以僅攜帶綠色熒光蛋白GFP的陰性對(duì)照腺病毒(Ad-GFP)轉(zhuǎn)染組和只添加無(wú)血清培養(yǎng)

10、基DMEM的空白組作為對(duì)照,初步研究PTEN基因?qū)SMC凋亡和細(xì)胞周期相關(guān)信號(hào)分子通路的影響。
　　 材料和方法
　　 1.人氣道平滑肌細(xì)胞(ASMC)的分離、培養(yǎng)與鑒定:分離肺葉切除術(shù)患者切除的相對(duì)正常肺葉、肺段支氣管標(biāo)本,按照相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道和本課題小組已經(jīng)成熟的方法,采用組織塊貼壁培養(yǎng)法進(jìn)行人氣道平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng),取3～8代的氣道平滑肌細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)和形態(tài),并用抗平滑肌α-肌動(dòng)蛋白單克隆抗體

11、(α-SM actin)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定為人氣道平滑肌細(xì)胞。
　　 2.實(shí)驗(yàn)分組:將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為以下3組:①過(guò)表達(dá)PTEN組(Ad-PTEN):應(yīng)用腺病毒載體攜帶野生型PTEN基因以最佳感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)=100體外轉(zhuǎn)染ASMCs;②陰性對(duì)照組(Ad-GFP):應(yīng)用腺病毒空載體攜帶綠色熒光蛋白GFP以感染復(fù)數(shù)=100體外轉(zhuǎn)染ASMCs;③空白對(duì)照組(DMEM):只添加無(wú)血

12、清培養(yǎng)基DMEM體外培養(yǎng)ASMCs。
　　 3.重組腺病毒感染ASMCs:選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ASMCs,加入用無(wú)血清的DMEM稀釋的病毒液,置于37℃、飽和濕度、5％CO2培養(yǎng)箱中孵育,6-8 h后補(bǔ)加含有血清的完全培養(yǎng)基,繼續(xù)孵育24h后,更換完全培養(yǎng)基,通過(guò)在倒置熒光顯微鏡下和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)觀察病毒轉(zhuǎn)染效果。
　　 4.CCK-8法檢測(cè)病毒轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞毒性和3組氣道平滑肌細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況。
　　 5.Hoec

13、hst-33342染色觀察3組氣道平滑肌細(xì)胞凋亡情況。
　　 6.PE-7AAD雙標(biāo)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)3組氣道平滑肌細(xì)胞凋亡情況。
　　 7.PI單染后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)3組氣道平滑肌細(xì)胞各自的細(xì)胞周期分布情況。
　　 8.Western blotting免疫印跡法檢測(cè)四組氣道平滑肌細(xì)胞的PTEN、p-Akt、total—Akt、p-ERK1/2、total—ERK1/2、cleaved-Caspases-3、Caspa

14、ses-9、p21、CyclinD1蛋白以及內(nèi)參β—actin的表達(dá)。
　　 9.所有原始數(shù)據(jù)用(x)±s表示,用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。多重比較采用One Way ANOVA分析,組間比較采用LSD/Bonferroni法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果
　　 1.倒置顯微鏡在×100倍鏡下觀察,ASMCs未匯合之前多呈梭形或多邊形,細(xì)胞匯合后部分區(qū)域的細(xì)胞成束狀

15、排列,呈典型“峰與谷”狀。對(duì)平滑肌細(xì)胞特異的α-肌動(dòng)蛋白(α-SM actin)進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色,在×400高倍鏡下可見α-SM actin在氣道平滑肌細(xì)胞胞漿內(nèi)均勻分布,呈棕色平行纖維絲狀結(jié)構(gòu)。傳至第3-4代,平滑肌細(xì)胞純度為95％。
　　 2.Ad-GFP轉(zhuǎn)染人ASMCs1d后可在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光,表明重組腺病毒載體成功轉(zhuǎn)染ASMC。轉(zhuǎn)染2d后熒光顯微鏡低倍鏡下滿視野皆可見轉(zhuǎn)染陽(yáng)性的平滑肌細(xì)胞呈現(xiàn)明顯綠色熒光。

16、MOI=100轉(zhuǎn)染2d后,熒光顯微鏡觀察下顯示轉(zhuǎn)染效率達(dá)(95.19±0.39)％,流式細(xì)胞檢測(cè)顯示轉(zhuǎn)染效率可達(dá)(96.20±0.33)％。
　　 3.CCK-8法檢測(cè)3組氣道平滑肌細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況和細(xì)胞毒性:轉(zhuǎn)染腺病毒載體Ad-PTEN組、Ad-GFP組、空白對(duì)照組細(xì)胞第1、2、3天450 nm處吸光度值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=480.63、106.644、89.592,P=0.000),Ad-PTEN組吸光度值明顯低于Ad-GFP組

17、和空白對(duì)照組(P<0.05),表明Ad—PTEN組細(xì)胞的增殖低于陰性對(duì)照和空白對(duì)照組；進(jìn)一步檢測(cè)Ad—GFP組和空白對(duì)照組對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和毒性情況,發(fā)現(xiàn)兩組第1、2、3天在450 nm處吸光度值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=-0.327、1.149、-1.732,P=0.748、0.270、O.105),表明空載病毒對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)影響且無(wú)細(xì)胞毒性。
　　 4.Hoechst-33342染色觀察3組氣道平滑肌細(xì)胞凋亡情況:轉(zhuǎn)染腺病毒Ad-PTE

18、N組、Ad—GFP組和空白對(duì)照組第2、3、5、7天所測(cè)得的細(xì)胞凋亡率相比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值=1.650、0.412、0.085,P=0.245,0.674,0.919)。表明轉(zhuǎn)染PTEN基因并不能誘導(dǎo)正常的ASMCs產(chǎn)生凋亡。
　　 5.PE-7AAD雙標(biāo)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)3組氣道平滑肌細(xì)胞凋亡情況:轉(zhuǎn)染腺病毒載體Ad-PTEN、Ad-GFP組和空白對(duì)照組第2、3、5、7天PE-7AAD雙標(biāo)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè),3組的凋亡率無(wú)明顯

19、統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=1.988、2.569、0.127、0.064,P=0.191,0.131,0.882、0.939),也同時(shí)證明表明轉(zhuǎn)染PTEN基因并不能誘導(dǎo)正常的ASMCs產(chǎn)生凋亡。
　　 6.Western blotting免疫印跡法檢測(cè)PTEN蛋白的表達(dá):成功轉(zhuǎn)染腺病毒載體Ad-PTEN后,過(guò)表達(dá)PTEN基因組細(xì)胞的PTEN蛋白表達(dá)增強(qiáng)；而Ad-GFP組和空白對(duì)照組PTEN蛋白的表達(dá)無(wú)明顯變化。
　　 7.West

20、ern blotting免疫印跡法檢測(cè)Akt蛋白的表達(dá):轉(zhuǎn)染腺病毒載體Ad-PTEN后,過(guò)表達(dá)PTEN基因組細(xì)胞的p-Akt表達(dá)顯著減少,但3組細(xì)胞的total-Akt表達(dá)無(wú)明顯差異。
　　 8.Western blotting免疫印跡法檢測(cè)ERK1/2蛋白的表達(dá):轉(zhuǎn)染腺病毒載體Ad-PTEN后,p-ERK1/2和total-Akt的表達(dá)與Ad—GFP組和空白對(duì)照組相比較無(wú)明顯差異。
　　 9.Western blott

21、ing免疫印跡法檢測(cè)cleaved—Caspases-3、Caspases-9蛋白的表達(dá):轉(zhuǎn)染腺病毒載體Ad-PTEN與Ad-GFP組和空白對(duì)照組相比較,3組的cleaved-Caspases-3、Caspases-9蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異。
　　 10.PI單染的流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果:轉(zhuǎn)染腺病毒載體Ad-PTEN48h后,G0-G1期細(xì)胞增多,S期細(xì)胞和G2/M期細(xì)胞則減少。Ad-PTEN組、Ad-GFP組、空白對(duì)照組細(xì)胞G

22、0/G1期相比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.333,P=0.005)。Ad-PTEN組G0/G1期細(xì)胞與Ad-GFP組、空白對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明轉(zhuǎn)染Ad-PTEN能阻滯細(xì)胞在G0/G1期。
　　 11.Western blotting免疫印跡法檢測(cè)p21蛋白的表達(dá):轉(zhuǎn)染腺病毒載體Ad-PTEN組與Ad-GFP組和空白對(duì)照組相比較,p21蛋白的表達(dá)明顯上調(diào),而Ad-GFP組和空白對(duì)照組相比較表達(dá)無(wú)明顯差異

23、。
　　 12.Western blotting免疫印跡法檢測(cè)CyclinD1蛋白的表達(dá),轉(zhuǎn)染腺病毒載體Ad-PTEN組與Ad-GFP組和空白對(duì)照組相比較,CyclinD1蛋白的表達(dá)明顯下調(diào),而Ad-GFP組和空白對(duì)照組相比較表達(dá)無(wú)明顯差異。
　　 結(jié)論:本研究通過(guò)采用基因過(guò)表達(dá)技術(shù),研究了過(guò)表達(dá)腫瘤抑制基因PTEN對(duì)氣道平滑肌細(xì)胞(ASMC)凋亡和細(xì)胞周期的影響,并初步探討了p-Akt、total-Akt、p-ERK1

24、/2、total-ERK1/2、cleaved-Caspases-3、Caspases-9、p21、CyclinD1等信號(hào)分子的變化情況,通過(guò)上述研究我們得到了以下結(jié)論:
　　 1.腺病毒介導(dǎo)的表達(dá)系統(tǒng)能高效瞬時(shí)的在體外轉(zhuǎn)染ASMC。其轉(zhuǎn)染ASMC的效率可以達(dá)到95％左右。轉(zhuǎn)染后對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性,是一種安全的基因載體。
　　 2.PTEN基因的過(guò)表達(dá)不能誘導(dǎo)ASMC產(chǎn)生凋亡效應(yīng)。Hoechst-33342染色、PE-7AAD

25、雙標(biāo)流式細(xì)胞技術(shù)和免疫印跡cleaved-Caspases-3、Caspases-9蛋白的表達(dá)均證實(shí)了這點(diǎn)。此結(jié)果與PTEN基因能誘導(dǎo)某些類型的細(xì)胞凋亡的結(jié)論不同。
　　 3.PTEN基因的過(guò)表達(dá)能夠抑制ASMC的增殖和細(xì)胞周期進(jìn)展,G0-G1期細(xì)胞的比例增多,而S期和G2/M期細(xì)胞的比例減少。這與PTEN作用于其他類型的細(xì)胞的結(jié)果相似。
　　 4.過(guò)表達(dá)PTEN基因能下調(diào)p-Akt調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖而對(duì)p-ERK1/2、to