PTEN基因重組腺病毒對(duì)人氣道平滑肌細(xì)胞增殖的影響及其作用機(jī)制的探討.pdf

1、一、研究背景 支氣管哮喘是氣道的慢性炎癥性、過敏性疾病，其反復(fù)發(fā)作可引起氣道重塑，近年來成為支氣管哮喘（簡稱哮喘）研究中的一個(gè)亮點(diǎn)。氣道重塑指的是哮喘中發(fā)生于氣道壁的結(jié)構(gòu)改變，這些改變包括上皮細(xì)胞的增生和化生，上皮下纖維化，肌細(xì)胞增生和血管發(fā)生。氣道平滑肌細(xì)胞（airway smooth muscle cells，ASMCs）是氣道主要的結(jié)構(gòu)和功能細(xì)胞，在氣道重塑中起重要作用，哮喘時(shí)ASMC生物學(xué)特性發(fā)生很大變化，包括增生，肥大

2、，遷移等，不僅使支氣管對(duì)刺激的收縮反應(yīng)更強(qiáng)烈，加重氣道高反應(yīng)性，而且增殖的ASMC使氣道壁增厚，導(dǎo)致基礎(chǔ)氣道阻力增加和不可逆性氣流阻塞的發(fā)生。 與張力蛋白和輔助蛋白同源，第10號(hào)染色體丟失的磷酸酶基因（phophatase and tensin homolog deleted on chromosone10，PTEN）是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的抑癌基因，是至今發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)具有磷酸酶活性的抑癌基因。PTEN作為一種具有雙重磷酸酶活性的

3、腫瘤抑制因子，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心臟、肝臟、腎臟、胃腸道、肺臟及皮膚等全身多器官均有表達(dá)，是一種細(xì)胞內(nèi)固有表達(dá)的非分泌型蛋白。正常組織內(nèi)PTEN的廣泛表達(dá)及其基礎(chǔ)活性的存在，提示PTEN參與了多種生理過程，對(duì)細(xì)胞的生長、增殖、分化、凋亡、黏附、遷移和血管生長等許多生物學(xué)行為有重要影響。近年來，對(duì)PTEN的研究逐漸從腫瘤領(lǐng)域延伸到一些非腫瘤領(lǐng)域中，隨著研究的深入人們發(fā)現(xiàn)其在如：心肌肥大，高血壓動(dòng)脈粥樣硬化，支氣管哮喘哮等非腫瘤性疾病中也發(fā)揮

4、重要的作用。 已有的研究已經(jīng)證實(shí)PTEN可以通過對(duì)磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）及黏著斑激酶（FAK）等信號(hào)通路的抑制來抑制腫瘤細(xì)胞，心肌和血管平滑肌等細(xì)胞的增殖、遷移。P13K/PKB/AKT通路同時(shí)是介導(dǎo)ASMC增殖的主要信號(hào)傳導(dǎo)通路。因此我們推斷PTEN對(duì)ASMC的增殖也有類似的影響，可以通過對(duì)PI3K/PKB/AKT通路的抑制來抑制ASMC增殖，提高人氣道平滑肌細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞的比例，

5、阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程。 二、研究目的 本實(shí)驗(yàn)以體外培養(yǎng)的HASMCs為研究對(duì)象，觀察攜帶野生型PTEN基因的重組腺病毒（Ad-PTEN）體外轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的人氣道平滑肌細(xì)胞（HASMC）后的表達(dá)，研究其對(duì)體外培養(yǎng)的HASMC增殖的影響，并對(duì)其作用機(jī)制作初步的探討，為其治療支氣管哮喘氣道重構(gòu)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 三、材料與方法 1．經(jīng)患者同意，取南方醫(yī)院胸外科同期做肺葉切除術(shù)患者的正常肺葉、段支氣管標(biāo)本。 2．

6、組織塊貼壁法培養(yǎng)人支氣管平滑肌細(xì)胞，倒置顯微鏡觀察和抗平滑肌α肌動(dòng)蛋白單克隆抗體（α-actin）免疫細(xì)胞化學(xué)法進(jìn)行HASMCs鑒定。 3．通過攜帶野生型PTEN基因的重組腺病毒（Ad-PTEN）體外轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的人氣道平滑肌細(xì)胞構(gòu)建過度表達(dá)PTEN的原代培養(yǎng)氣道平滑肌細(xì)胞模型，通過追蹤綠色熒光蛋白（GFP）的表達(dá)，檢測(cè)不同感染倍數(shù)（M．O．I．）的感染效率，以及感染后24h，48h和72h時(shí)GFP表達(dá)陽性率，確定合適的感染倍數(shù)

7、和病毒表達(dá)時(shí)間。 4．用RT-PCR及Western Blot檢測(cè)受感染細(xì)胞內(nèi)PTEN的mRNA及蛋白表達(dá)，檢測(cè)通過腺病毒感染介導(dǎo)能否有效地引起氣道平滑肌細(xì)胞內(nèi)過度表達(dá)PTEN。 5．MTS/PMS微量比色法檢測(cè)各組吸光度（OD490值）以了解HASMC的增殖情況。 6．各組細(xì)胞PI單染后流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期分布。 7．Western Blot檢測(cè)各組細(xì)胞Akt及p-Akt的蛋白表達(dá)。 8．RT

8、-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞P21mRNA的表達(dá)。 9．采用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行結(jié)果分析，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±S）表示，組間比較用one-way ANOVA分析，多重比較用LSD，P<0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 四、結(jié)果 1．HASMCs的形態(tài)及免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定 倒置顯微鏡下ASMCs呈長梭形，生長至融合后，細(xì)胞呈現(xiàn)出特征的“峰谷”狀。免疫細(xì)胞化學(xué)法對(duì)平滑肌細(xì)胞表型標(biāo)志物α-肌動(dòng)蛋白（α-act

9、in）鑒定，光鏡下可見細(xì)胞漿中較多棕黃色顆粒。 2．Ad-PTEN和Ad-GFP感染氣道平滑肌細(xì)胞后，GFP表達(dá)陽性率隨著M．O．I．和時(shí)間增加而增加；M．O．I．達(dá)到100時(shí)，細(xì)胞GFP陽性率達(dá)到98%以上；M．O．I．200感染效率較M．O．I．100細(xì)胞無明顯變化；各種M．O．I．感染48h后，GFP陽性表達(dá)趨于穩(wěn)定，72h熒光表達(dá)陽性細(xì)胞比較48h時(shí)無明顯改變，主要表現(xiàn)為熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。因此確定M．O．I．100感染氣道平

10、滑肌細(xì)胞48h后作為進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)的適宜表達(dá)時(shí)間。 3．RT-PCR同時(shí)擴(kuò)增Ad-PTEN轉(zhuǎn)染組，Ad-GFP轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組PTEN mRNA，結(jié)果顯示Ad-PTEN轉(zhuǎn)染組PTEN mRNA的表達(dá)水平顯著高于Ad-GFP轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組（P<0．05），Ad-GFP轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0．05）。Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，Ad-PTEN轉(zhuǎn)染組PTEN蛋白表達(dá)水平顯著高于Ad-GFP轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組（P<0

11、．05），Ad-GFP轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0．05）。提示攜帶外源基因PTEN的腺病毒感染氣道平滑肌細(xì)胞后，Ad-PTEN轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)過度表達(dá)PTEN mRNA及蛋白。 4．MTS/PMS法檢測(cè)攜帶野生型PTEN基因的重組腺病毒（Ad-PTEN）轉(zhuǎn)染對(duì)HASMCs增殖的影響，結(jié)果顯示Ad-PTEN轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的吸光度（OD490值）顯著低于Ad-GFP轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組（P<0．05）；而Ad-GFP轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組間

12、差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0．05）。 5．流式細(xì)胞儀檢測(cè)攜帶野生型PTEN基因的重組腺病毒（Ad-PTEN）轉(zhuǎn)染對(duì)HASMCs細(xì)胞周期的影響，結(jié)果顯示Ad-PTEN轉(zhuǎn)染組G0/G1期細(xì)胞的比例顯著大于Ad-GFP轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組（P<0．05），Ad-GFP轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0．05）。各組的S期及G2/M期細(xì)胞比例的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0．05）。 6．Western blot結(jié)果顯示，各組細(xì)胞間總A

13、KT水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0．05），而Ad-PTEN轉(zhuǎn)染組p-AKT蛋白表達(dá)水平顯著低于Ad-GFP轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組（P<0．05），Ad-GFP轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0．05）。 7．RT-PCR同時(shí)擴(kuò)增Ad-PTEN轉(zhuǎn)染組，Ad-GFP轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組P21 mRNA，結(jié)果顯示Ad-PTEN轉(zhuǎn)染組P21 mRNA的表達(dá)水平顯著高于Ad-GFP轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組（P<0．05），Ad-GFP轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組間差異無

14、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0．05）。 結(jié)論: 1．通過腺病毒感染成功構(gòu)建過度表達(dá)PTEN的原代培養(yǎng)氣道平滑肌細(xì)胞模型，其能有效地引起氣道平滑肌細(xì)胞內(nèi)過度表達(dá)PTEN。 2．通過腺病毒介導(dǎo)的氣道平滑肌細(xì)胞內(nèi)PTEN過度表達(dá)能夠抑制氣道平滑肌細(xì)胞的增殖，可提高人氣道平滑肌細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞的比例，阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程。 3．通過腺病毒介導(dǎo)的氣道平滑肌細(xì)胞內(nèi)PTEN過度表達(dá)能夠?qū)I3K/PKB/AKt信號(hào)通路表現(xiàn)出抑制