腺病毒介導Gax基因轉(zhuǎn)染對低氧性大鼠肺動脈平滑肌細胞增殖和凋亡的影響及機制探討.pdf

1、背景和目的： 肺動脈平滑肌細胞(PASMCs)由收縮表型向合成表型轉(zhuǎn)變，并從中膜遷移于內(nèi)膜大量增殖，是低氧性肺動脈高壓(HPH)肺血管結(jié)構(gòu)重建(PVSR)的基本病理變化。PASMCs的增殖加速和凋亡減慢可以視為PVSR血管內(nèi)膜過度增生的演變核心。以PASMCs增殖和凋亡為切入點，探討HPH的發(fā)病機制，尋求HPH有效防治策略已成為目前研究前沿的重點和熱點。 有關(guān)生長因子、生長因子受體及其信號傳導通路在PASMCs的生物學行

2、為異常中的作用研究較為深入。但關(guān)于核轉(zhuǎn)錄因子如何將這些信號進行整合并啟動級聯(lián)調(diào)節(jié)反應的研究尚欠缺。Gax基因是近年來發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)血管平滑肌細胞生物學行為的核轉(zhuǎn)錄因子基因之一。研究證實Gax(growth-arresthomeobox)基因是一個主要存在于心血管系統(tǒng)的同源盒基因，同源盒基因在胚胎發(fā)育中調(diào)節(jié)細胞的生長、分化和遷移。增強Gax基因表達可以抑制心血管平滑肌細胞的增殖并誘導其凋亡。以往的研究側(cè)重于Gax基因在心血管平滑肌細胞增殖和凋

3、亡中的作用，而有關(guān)Gax基因在肺動脈平滑肌細胞中的作用研究，目前亦尚欠缺。此外，研究側(cè)重于Gax基因?qū)ρ芷交≡鲋车挠绊?，對其誘導細胞凋亡的研究亦顯不足。鑒于肺動脈平滑肌細胞與心血管平滑肌細胞的生物學特性具有相似性，我們推測增強Gax基因表達對低氧性PASMCs可能也有抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡的作用。因此，本實驗首先觀察正常大鼠PASMCs中是否有Gax基因表達，以及低氧對PASMCs中Gax基因表達是否有影響；其次通過攜帶Gax基

4、因的重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的大鼠PASMCs，觀察增強Gax基因表達對常氧和低氧條件下PASMCs增殖和凋亡的影響，以及原癌基因和凋亡相關(guān)基因表達的變化，探討Gax基因在低氧性PASMCs增殖和凋亡中的作用和機制。 方法： 1.采用組織塊貼壁法，顯微鏡觀察和α-SM-actin免疫細胞化學方法原代培養(yǎng)和鑒定大鼠PASMCs。 2.TR-PCR、免疫細胞化學和Westernblot法檢測常氧和低氧條件下PASM

5、Cs中GaxmRNA和蛋白表達的變化。 3.用293細胞作為包裝細胞擴增、氯化銫梯度離心純化、空斑形成實驗、PCR、RT-PCR和Westemblot鑒定攜帶大鼠Gax基因表達序列的重組腺病毒載體(Ad-Gax)及觀察其表達，制備高效、高滴度的病毒轉(zhuǎn)染液。 4.以病毒轉(zhuǎn)染液常規(guī)轉(zhuǎn)染PASMCs后，應用RT-PCR和免疫細胞化學方法分別檢測Gax基因在常氧和低氧條件下PASMCs轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達。 5.應用四唑

6、鹽(MTT)比色試驗、3H標記的胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)摻入試驗、流式細胞儀、電鏡和TUNEL染色觀察Gax基因表達增強對在常氧和低氧條件時PASMCs增殖、和凋亡的影響。 6.應用免疫細胞化學染色和RT-PCR技術(shù)，在常氧和低氧條件下，分別觀察Gax基因轉(zhuǎn)染前后PASMCs中與增殖相關(guān)的原癌基因(c-fos、c-jun)以及與凋亡相關(guān)的凋亡相關(guān)基因(Bax、Bcl-2)表達的變化。 結(jié)果： 1.經(jīng)細胞形態(tài)學

7、和α-SM-actin免疫細胞化學方法鑒定，應用大鼠肺動脈原代培養(yǎng)所得細胞正是預期的PASMCs。可以用于進一步的實驗。 2.在常氧和低氧條件下，用TR-PCR、免疫細胞化學和Westernblot法均檢測到PASMCs中有GaxmRNA和蛋白的表達。低氧可以下調(diào)Gax基因在PASMCs中的表達水平，并且隨著低氧時間的延長，Gax基因表達下降程度更加顯著。 3.成功地擴增、純化和鑒定了攜帶大鼠Gax基因表達序列的重組腺病

8、毒載體，并純化制備高效高滴度病毒轉(zhuǎn)染液。獲得70μl純化病毒液，滴度高達1.0×1010-3.6×1011pfu/ml，最佳感染復數(shù)為80的Ad-Gax轉(zhuǎn)染液。Ad-Gax轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞后出現(xiàn)Gax基因高表達，提示Ad-Gax可以用于后續(xù)實驗。 4.流式細胞儀檢測和免疫細胞化學染色均顯示Ad-Gax轉(zhuǎn)染PASMCs后，PASMCs的Gax蛋白表達率明顯增高，轉(zhuǎn)染后12小時即可超過80％，高水平的表達可維持較長時間。

9、 5.Ad-Gax轉(zhuǎn)染后，Gax基因在PASMCs中能夠高效過表達。增強PASMCs中Gax基因的表達后，無論有無低氧刺激，PASMCs中Gax基因的表達均比轉(zhuǎn)染前顯著增加(P＜0.01)。 6.Ad-Gax轉(zhuǎn)染使PASMCs中表達Gax增強后，PASMCs中的MTT吸光度值和3H-TdR摻入量均較未轉(zhuǎn)染組顯著降低，PASMCs中G0/G1比例較未轉(zhuǎn)染組顯著增高(P＜0.01)，S+G2/M比例顯著降低(P＜0.01)。

10、 7.在低氧條件下Ad-Gax轉(zhuǎn)染使PASMCs中的c-fos、c-junmRNA表達比未轉(zhuǎn)染組顯著降低(P＜0.01)。 8.無Ad-Gax轉(zhuǎn)染時，低氧刺激前后，均無或可見極少量的TUNEL染色陽性細胞；Ad-Gax轉(zhuǎn)染后，如無低氧刺激，也無或僅可見少量的TUNEL染色陽性細胞，予低氧刺激后，TUNEL染色陽性細胞顯著增多，尤其在轉(zhuǎn)染后24小時至48小時更明顯。 9.Ad-Gax轉(zhuǎn)染前，與常氧時比較，低氧刺激PASMC

11、s后，Bax蛋白表達略為升高但均沒有顯著意義(P＞0.05)；而Bcl-2蛋白表達顯著升高且有顯著性差異(P＜0.01)。Ad-Gax轉(zhuǎn)染PASMCs后，低氧刺激可使Bax蛋白表達顯著增高(P＜0.05)，Bcl-2蛋白表達顯著降低(P＜0.01)，且凋亡率與Bcl-2/Bax比值呈負相關(guān)關(guān)系。 結(jié)論： 1.本實驗證實了正常PASMCs在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上都有Gax基因的表達；低氧可使PASMCs中Gax基因在細胞轉(zhuǎn)錄和翻

12、譯水平的表達均下調(diào)，并且隨著低氧時間的延長，下調(diào)程度越來越顯著，具有時間依賴性。說明低氧是下調(diào)PASMCs中Gax基因表達的一個因素。 2.Ad-Gax重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染PASMCs后，Gax基因能夠在PASMCs中進行高效過表達。 3.低氧能夠誘導PASMCs增殖；Ad-Gax轉(zhuǎn)染使PASMCs中Gax基因過表達后，可抑制低氧引起的PASMCs增殖，其作用機制可能與Gax基因下調(diào)c-fos、c-junmRNA表達有關(guān)。