RNA干擾對HCMV引起平滑肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用研究.pdf

1、目的： 動脈粥樣硬化(AtheroscleFOSis，AS)嚴(yán)重威脅人類健康，是發(fā)達(dá)國家人口死亡的主要原因，在我國AS的發(fā)病率也呈逐年增高的趨勢。研究證明血管炎癥反應(yīng)在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用。血清流行病學(xué)和分子生物學(xué)的研究資料表明，人類巨細(xì)胞病毒(Human cytomegalovirus，HCMV)抗原及其DNA序列存在于AS的病灶組織，主要見于血管平滑肌細(xì)胞(vascular Smooth Musclecel

2、ls，VSMC)和內(nèi)皮細(xì)胞(vein erldothelial cell，ECV)，且AS患者血清HCMV的抗體陽性率明顯增高，提示HCMV的感染對AS的形成和發(fā)生發(fā)展起重要作用。迄今為止，對于HCMV如何參與AS的發(fā)病機(jī)制尚缺乏深入的了解，研究體外情況下HCMV感染后血管壁細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)，對闡明HCMV致AS機(jī)理具有非常重要的意義；VSMC表達(dá)的氧化型低密度脂蛋白受體-1(Lectin-like oxidized low densi

3、tv lipoprotein receptor-1，L,OX-1)是氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，OX-LDL)最重要的受體之一，也是VSMC結(jié)合或者內(nèi)吞OX-LDL的最重要受體之一，該受體還可誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)到血管內(nèi)膜下間隙，刺激平滑肌細(xì)胞增生并釋放多種炎性細(xì)胞因子，同時VSMC內(nèi)吞OX-LDL轉(zhuǎn)化成泡沫細(xì)胞。外周血單核細(xì)胞粘附于內(nèi)皮并遷入內(nèi)皮下間隙，攝取脂質(zhì)轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞是

4、動脈粥樣硬化形成的重要早期事件，單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoatt ractant protein-1，MCP-1)在這一過程中起重要作用；MCP-1還可通過促進(jìn)VSMC增殖，參與AS的病理過程。 本課題通過構(gòu)建siRNA質(zhì)粒，調(diào)節(jié)HCMV誘導(dǎo)兔血管平滑肌細(xì)胞LOX-1、MCP-1表達(dá)以及HCMV的復(fù)制，觀察siRNA質(zhì)粒是否對LOX-1、MCP-1表達(dá)以及ItCMV復(fù)制有抑制作用，從而明確HCMV通過上

5、調(diào)LOX-1和MCP-1表達(dá)參與動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，探討siRNA在HCMV感染加劇動脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制中的可能治療作用。 方法： 1．設(shè)計(jì)和構(gòu)建RNA干擾質(zhì)粒設(shè)計(jì)靶基因，采用化學(xué)合成法獲得目的基因，將目的基因ORF與odsRED2-N1質(zhì)粒連接后成RFP融合蛋白表達(dá)載體，進(jìn)行RNAi有效靶點(diǎn)篩選后用293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝獲得rabLOX-1質(zhì)粒。 2. 兔主動脈平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)將血管中膜的內(nèi)中層進(jìn)行組

6、織塊培養(yǎng)并鑒定，待細(xì)胞呈亞單層狀態(tài)，按常規(guī)方法進(jìn)行傳代，第3-8代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。 3. 基因轉(zhuǎn)染 實(shí)驗(yàn)分為五組：正常細(xì)胞對照組：用含2﹪血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)VSMC細(xì)胞；rabLOX-1組：按100MOI濃度接種慢病毒質(zhì)粒rabLOX-1，37℃吸附2h后，棄病毒液，用含2﹪血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞；HCMV感染組：以100TCID<,50>/0.1ml濃度接種HCMV ADl69病毒株于70-80﹪融合的VSMC，37℃吸

7、附1h后，棄病毒液，用含2﹪血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞；HCMV+rabLOX-1組：按100TCID<,50>/0.1ml濃度接種HCMVADl69病毒株于VSMC單層細(xì)胞，再按100MOI濃度接種慢病毒質(zhì)粒rabLOX-1，用含2﹪血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞；HCMV+空載體組：按100TCID<,50>/0.1ml濃度接種HCMVADl69病毒株于VSMC單層細(xì)胞，再按100MOI濃度接種慢病毒空載體，用含2﹪血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。

8、 4. 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測LOX-1mRNA、MCP-lmRNA和HCMVIE72mRNA表達(dá)變化用Trizol提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，：PCR擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察電泳結(jié)果并拍照、掃描。將凝膠電泳圖條帶密度進(jìn)行計(jì)算機(jī)分析，計(jì)算電泳條帶與GAPDH擴(kuò)增條帶光密度值作為其相對表達(dá)強(qiáng)度。 5. 蛋白印記法(Western blotting)測LOX-1蛋白表達(dá)收集細(xì)胞提取總蛋白并

9、測蛋白濃度后，電泳轉(zhuǎn)膜后，進(jìn)行免疫反應(yīng)，避光顯色至出現(xiàn)條帶并進(jìn)行軟件分析。 結(jié)果： 1. 經(jīng)測序及酶切鑒定證明成功構(gòu)建了慢病毒包裝的rabLOX-1； 2. 免疫組織化學(xué)證實(shí)平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)成功； 3. RT-PCR結(jié)果顯示：HCMV+rabLOX-1組中LOX-1mRNA有低水平表達(dá)，與正常細(xì)胞對照組和rabLOX-1組差異不明顯，在HCMV組和空載體組表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.01)；MCP-1m

10、RNA在正常細(xì)胞對照組和rabLOX-1組表達(dá)水平較低，在HCMV組和HCMV+空載體組表達(dá)明顯增強(qiáng)，與HCMV+rabLOX-1組、正常細(xì)胞對照組及rabLOX-1組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；HCMV IE72mRNA在HCMV組明顯高于HCMV+rabLOX-1組。提示siRNA質(zhì)?？梢杂行б种艸CMV引起的平滑肌細(xì)胞LOX-1和MCP-1上調(diào)表達(dá)效應(yīng)，抑制病毒自身在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。 4. Western blotti