線粒體膜ATP敏感鉀通道在缺氧性肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖-凋亡失衡中的作用.pdf

1、研究背景
　　 肺動(dòng)脈高壓和肺心病的發(fā)病率和死亡率仍然居高不下，嚴(yán)重威脅著人類的健康。缺氧性肺動(dòng)脈高壓是最常見的類型，其發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡述清楚，其中缺氧性肺血管收縮和缺氧性肺血管重建是被認(rèn)為是其兩大主要的病理生理基礎(chǔ)。目前認(rèn)為，缺氧引起的肺血管收縮并非完全依賴于血管內(nèi)皮細(xì)胞，血管平滑肌細(xì)胞也參與了肺血管收縮反應(yīng)。在影響血管張力的各種因素中，血管平滑肌細(xì)胞鉀通道和細(xì)胞內(nèi)鈣離子發(fā)揮著十分重要的作用。研究表明缺氧可抑制肺動(dòng)脈平滑

2、肌細(xì)胞鉀通道的活性，引起肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(PASMCs)去極化，達(dá)到一定閾值后，電壓依賴性鈣通道開放，引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，作為重要的第二信使，鈣離子促使肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞收縮、增殖和遷移，也可激活各種蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)一步引起缺氧性肺血管收縮和肺血管重建，最終導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓。
　　 第一部分
　　 分題一 線粒體膜ATP敏感鉀通道對(duì)缺氧大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素C分布的變化及細(xì)胞增殖中的作用
　　

3、 目的：研究線粒體膜上ATP敏感的鉀通道和線粒體膜電位在缺氧影響大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素C在細(xì)胞漿和線粒體內(nèi)分布的變化及以及其引起細(xì)胞增殖變化中的作用，旨在探索缺氧性肺動(dòng)脈重建和肺動(dòng)脈高壓形成的發(fā)生機(jī)制，為尋找新的防治方法 提供試驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：獲取大鼠正常肺組織，分離出肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞進(jìn)行常氧或慢性缺氧培養(yǎng)。將標(biāo)本分為六組：①正常對(duì)照組；②MitoKATP阻斷劑5-HD組；③MitoKATP開放劑Diazoxide

4、組；④慢性缺氧(CH)組；⑤CH+5-HD組；⑥CH+Diazoxide組。利用激光共聚焦顯微鏡(Leica SP-1 USA)成像檢測(cè)線粒體膜電位，線粒體/胞漿成離試劑盒分離線粒體和胞漿成分后，Western blot法檢測(cè)兩者細(xì)胞色素C，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。
　　 結(jié)果：①Diazoxide作用24h后，與正常對(duì)照組比較，R-123熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，線粒體膜電位去極化，細(xì)胞胞漿細(xì)胞色素C與線粒體

5、細(xì)胞色素C的比值明顯降低，細(xì)胞呈增殖明顯增多、凋亡明顯減少，與正常對(duì)照組相比較均P<0.05；而5-HD作用24h與正常對(duì)照組比較，上述指標(biāo)無(wú)明顯變化，②慢性缺氧24h，結(jié)果與Diazoxide組相似，與正常對(duì)照組比較，R-123熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，線粒體膜電位去極化，細(xì)胞胞漿細(xì)胞色素C與線粒體細(xì)胞色素C的比值明顯降低，細(xì)胞呈增殖明顯增多、凋亡明顯減少，與正常對(duì)照組相比較均P<0.05；；CH+Diazoxide組，與缺氧組比較，R-12

6、3熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，線粒體膜電位去極化，細(xì)胞胞漿細(xì)胞色素C與線粒體細(xì)胞色素C的比值明顯降低，細(xì)胞呈增殖明顯增多、凋亡明顯減少，與正常對(duì)照組相比較均P<0.05；CH+5-HD組，與缺氧組比較，R-123熒光強(qiáng)度明顯減弱，線粒體膜電位部分消失，細(xì)胞胞漿細(xì)胞色素C與線粒體細(xì)胞色素C的比值明顯升高，細(xì)胞增殖明顯減少、凋亡明顯增多，與正常對(duì)照組相比較均P<0.05。
　　 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，缺氧可以引起MitoKATP的開放以及 m

7、的去極化，并進(jìn)而抑制了細(xì)胞色素C從細(xì)胞線粒體釋放到細(xì)胞漿，抑制線粒體凋亡途徑，從而參與并影響了肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生發(fā)展。
　　 分題二 線粒體膜ATP敏感鉀通道對(duì)缺氧大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞氧自由基的變化及細(xì)胞增殖中的作用
　　 目的：研究線粒體ATP敏感性鉀通道和線粒體膜電位在缺氧影響大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)氧自由基的變化及細(xì)胞增殖中的作用，旨在探索缺氧性肺動(dòng)脈重建和肺動(dòng)脈高壓形成的發(fā)生機(jī)制，為尋找新的防治方法的提供試驗(yàn)依據(jù)

8、。
　　 方法：獲取大鼠正常肺組織，分離出肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞進(jìn)行常氧或慢性缺氧培養(yǎng)。將標(biāo)本分為六組：①正常對(duì)照組；②MitoKATP阻斷劑5-HD組；③MitoKATP開放劑Diazoxide組；④慢性缺氧(CH)組；⑤CH+5-HD組；⑥CH+Diazoxide組。利用激光共焦顯微鏡(Leica SP-1 USA)成像檢測(cè)線粒體膜電位，熒光染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)氧自由基含量，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。
　　

9、 結(jié)果：①Diazoxide作用24h后，與正常對(duì)照組比較，R-123熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，線粒體膜電位去極化，細(xì)胞內(nèi)氧自由基含量明顯增加，細(xì)胞呈增殖明顯增多、凋亡明顯減少；而5-HD作用24h后，上述指標(biāo)與正常對(duì)照組相比較，均無(wú)顯著性差異；②慢性缺氧24h，結(jié)果與Diazoxide組相似，與正常對(duì)照組比較，R-123熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，線粒體膜電位去極化，細(xì)胞內(nèi)氧自由基含量明顯增加，細(xì)胞呈增殖明顯增多、凋亡明顯減少；CH+Diazoxid

10、e組，與缺氧組比較，R-123熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，線粒體膜電位去極化，細(xì)胞內(nèi)氧自由基含量明顯增加，細(xì)胞呈增殖明顯增多、凋亡明顯減少；CH+5-HD組，與缺氧組比較，R-123熒光強(qiáng)度明顯減弱，線粒體膜電位部分消失，細(xì)胞內(nèi)氧自由基含量明顯下降，細(xì)胞呈增殖明顯減少、凋亡明顯增多。
　　 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Diazoxide能夠通過(guò)開放線粒體膜上ATP敏感的鉀通道，引起Δψm去極化，Δψm的變化影響細(xì)胞內(nèi)氧自由基的含量，氧自由基作為

11、信號(hào)分子影響肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖/凋亡的平衡。
　　 第二部分
　　 分題一 線粒體膜ATP敏感鉀通道對(duì)缺氧人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素C分布的變化及細(xì)胞增殖中的作用
　　 目的：為了探索線粒體ATP敏感鉀通道和線粒體膜電位在細(xì)胞缺氧信號(hào)傳導(dǎo)中的作用以及在缺氧性人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞細(xì)胞色素C在細(xì)胞內(nèi)的分布及細(xì)胞增殖中的影響。
　　 方法：本實(shí)驗(yàn)將人動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞進(jìn)行常氧或24小時(shí)缺氧培養(yǎng)，并將標(biāo)本分為

12、六組：①對(duì)照組；②MitoKATP阻斷劑5-HD組；③MitoKATP開放劑Diazoxide組；④24小時(shí)缺氧組；⑤24小時(shí)缺氧合并5-HD組；⑥24小時(shí)缺氧合并Diazoxide組。利用激光共聚焦顯微鏡(Leica SP-1 USA)成像法檢測(cè)線粒體膜電位；線粒體/胞漿成分分離試劑盒(BioVision)分離線粒體和胞漿成分后，Western blot法檢測(cè)兩者細(xì)胞色素C；Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中caspase-9的蛋白

13、表達(dá)量；MTT法及PI染色后流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。
　　 結(jié)果：①Diazoxide作用24 h后，R123熒光明顯增強(qiáng)，細(xì)胞胞漿細(xì)胞色素C與線粒體細(xì)胞色素C的比值明顯降低，caspase-9的蛋白表達(dá)顯著減少，細(xì)胞呈明顯增殖增多、凋亡減少，與正常對(duì)照組相比較均P<0.05；而5-HD作用24 h與正常對(duì)照組比較，上述指標(biāo)無(wú)明顯變化，P>0.05。②缺氧24 h后，結(jié)果與Diazoxide組相似，R123熒光明顯增強(qiáng)，細(xì)胞

14、胞漿細(xì)胞色素C與線粒體細(xì)胞色素C的比值明顯降低，caspase-9的蛋白表達(dá)顯著減少，細(xì)胞呈明顯增殖增多、凋亡減少，與正常對(duì)照組相比較均P<0.05；24小時(shí)缺氧合并Diazoxide組與缺氧組相比較，R123熒光明顯增強(qiáng)，細(xì)胞胞漿細(xì)胞色素C與線粒體細(xì)胞色素C的比值明顯降低，caspase-9的蛋白表達(dá)顯著減少，細(xì)胞呈明顯增殖增多、凋亡減少，P<0.05；而24小時(shí)缺氧合并5-HD組與缺氧組比較，R123熒光明顯降低，細(xì)胞胞漿細(xì)胞色素C

15、與線粒體細(xì)胞色素C的比值明顯升高，caspase-9的蛋白表達(dá)顯著增加，細(xì)胞呈明顯增殖減少、凋亡增多。
　　 結(jié)論：缺氧可以引起MitoKATP的開放以及 m的去極化，并進(jìn)而抑制了細(xì)胞色素C從細(xì)胞線粒體釋放到細(xì)胞漿，抑制線粒體凋亡途徑。
　　 分題二 線粒體膜ATP敏感鉀通道對(duì)缺氧人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞氧自由基的變化及細(xì)胞增殖中的作用
　　 目的：研究線粒體膜上ATP敏感鉀通道開放劑Diazoxide和線粒體膜電位在

16、缺氧影響人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)氧自由基的變化及細(xì)胞增殖中的作用，探索缺氧性肺動(dòng)脈重建和肺動(dòng)脈高壓形成的發(fā)生機(jī)制，為探索新的防治方法的提供試驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：培養(yǎng)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HPASMCs)，進(jìn)行常氧或慢性缺氧培養(yǎng)。將標(biāo)本分為六組：①對(duì)照組；②MitoKATP阻斷劑5-HD組；③MitoKATP開放劑Diazoxide組；④慢性缺氧組；⑤慢性缺氧合并5-HD組；⑥慢性缺氧合并Diazoxide組。利用激光共焦顯微鏡(

17、Leica SP-1 USA)成像檢測(cè)線粒體膜電位，熒光染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)氧自由基含量，免疫組化法檢測(cè)增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、C-fos及C-jun的表達(dá)和MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。
　　 結(jié)果：①Diazoxide作用24h后，與正常對(duì)照組(R123熒光強(qiáng)度、細(xì)胞內(nèi)氧自由基含量、PCNA、C-fos、C-jun的蛋白的積光度值及MTT的A值。
　　 結(jié)論：Diazoxide能夠通過(guò)開放線粒體膜上ATP敏感的鉀通道，引起