鈣信號與HIF在缺氧肺動脈平滑肌增殖中的作用探討.pdf

1、氧是維持人類生命活動所必須的基本物質之一。缺氧是高原病的直接原因，也是多種疾病發(fā)生和發(fā)展的過程中常見的病理生理過程。急性和慢性缺氧均可以導致缺氧性肺動脈高壓(hypoxic pulmonary hypertension，HPH)，后者病理生理基礎是肺動脈的收縮反應增強和血管壁結構改建(remodeling)。對于Ca<'2+>與缺氧性肺血管收縮的關系已經進行了大量研究。目前認為，缺氧時線粒體電子傳遞降低，電壓門控K<'+>通道(Kv通道

2、)周圍活性氧水平發(fā)生改變，使Kv通道受抑制(特別是Kv1.5和Kv2.1)，導致膜電位降低，Ca<'2+>內流增加，從而引起肺動脈平滑肌細胞(pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs)收縮，進而導致肺動脈壓升高。但是細胞內Ca<'2+>穩(wěn)態(tài)失衡與肺血管結構改建的關系尚不明確，特別是Ca<'2+>信號轉導中哪些環(huán)節(jié)起主要調節(jié)作用還不清楚。從本質上說，肺血管結構改建是缺氧作用下肺血管進行一系

3、列基因表達重新調整，進而其結構、功能、代謝發(fā)生重新調重的結果。證據(jù)表明，缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factor，HIF)是介導機體對缺氧發(fā)生基因表達重新調整的中心環(huán)節(jié)。最早在1992年發(fā)現(xiàn)HIF-1，隨后相繼發(fā)現(xiàn)了HIF-2、3、4，它們是分別由不同的α亞基和相同的β亞基構成的異二聚。眾多的研究證明HIF參與HPH的發(fā)生發(fā)展過程，可能主要從下述兩方面發(fā)揮作用：1)增加縮血管物質的生成，減少擴血管物質的生成；2)促

4、進肺動脈的重構。但是各家研究結果并不一致，很多環(huán)節(jié)尚待闡明。既然Ca<'2+>穩(wěn)態(tài)失衡和HIF水平改變分別是細胞對缺氧發(fā)生反應在細胞信號轉導和轉錄調節(jié)水平的兩個關鍵環(huán)節(jié)，那么有理由推測二者之間可能存在密切關系，共同參與細胞對缺氧反應的調節(jié)。本研究在PASMCs缺氧模型上，研究HIF表達的時相特點，應用Ca<'2+>信號轉導不同環(huán)節(jié)的工具藥物，探討Ca<'2+>信號通路如何參與缺氧性PASMCs增殖，并初步探討鈣信號是否與HIF-2α有一

5、定關聯(lián)。 方法： 組織塊法培養(yǎng)肺動脈平滑肌細胞，細胞長到一定數(shù)量時，分為常氧組和缺氧組，應用MTT檢測細胞活性，初步判斷6 h、12 h、24 h、48 h中哪個為檢測細胞增殖的最佳時間點。為了觀察鈣信號通路與缺氧誘導的PASMCs增殖的關系，將細胞同步化后分成常氧組、缺氧組、缺氧+L-型鈣通道阻滯劑硝苯吡啶(nifedipine，NFD 10μM)組、缺氧+鈣調素拮抗劑三氟拉嗪(trifluoperazine，TFP

6、10μM)組、缺氧+核轉錄因子NF-кB抑制劑PDTC(20μM)組、缺氧+細胞內鈣離子螯合劑BAPTA/AM(20 μM)組，缺氧及其缺氧加藥組放入2％氧濃度的缺氧培養(yǎng)，一段時間后，取出細胞進行各組細胞MTT檢測活性，流式細胞術分析細胞周期分布，免疫熒光檢測PCNA表達。 為了研究PASMCs的HIF的時相表達特點，當細胞長到一定數(shù)量時，去血清同步化處理，分為常氧組和缺氧組，分別培養(yǎng)12 h、24 h、48 h、72 h后取出

7、，提取RNA和蛋白，用RT-PCR方法檢測各組HIF-1α、HIF-2α、HIF-β mRNA表達，Western blot檢測其個時間點的蛋白表達。 細胞同步化處理后，分為常氧組和缺氧組，各組內再分別設對照組、NFP(10μM)組、T-型鈣通道阻滯劑鹽酸阿米洛利(amiloride hydrochaeridae，100μM)組、BAPTA/AM(15μM)組以及TFP(7.5μM)組，培養(yǎng)24 h后，檢測各個工具藥物對于HIF

8、-2α表達的影響，以初步確定鈣信號通路與HIF的關系。 結果： 1．MTT檢測細胞活性，細胞缺氧后與常氧組相比活性可見不同程度增高，但是在缺氧12 h時，缺氧和常氧組的差異最明顯，所以選擇12 h為檢測工具藥的作用時間點。 2．MTT檢測結果顯示，與常氧組相比，2％氧濃度培養(yǎng)PASMCs 12 h，細胞活力增加。L-型鈣通道阻滯劑、細胞內Ca<'2+>螯合劑、CaM拮抗劑和NF-кB抑制劑等各加藥組細胞活力與缺氧

9、組相比均受到不同程度的抑制，其中NFD、BAPTA和PDTC各組細胞活力接近常氧組的水平(與常氧組相比)，而TFP組細胞活力降低最為顯著，且與常氧組相比細胞活力顯著降低。 3．流式細胞測定結果顯示，與常氧對照組相比，缺氧組G0/G1期細胞比例顯著降低，S和G2/M期細胞比例均顯著增加。根據(jù)公式細胞增殖指數(shù)(proliferation index)：PI=(S+G2/M)/(S+G2/M+G0/G1)計算結果顯示，缺氧狀態(tài)下PI比

10、常氧組增加了約1.46倍(P<0.01)，L-型鈣通道阻滯劑、細胞內Ca<'2+>螯合劑、CaM拮抗劑和NF-кB抑制劑等各工具藥物均可顯著抑制缺氧誘導的細胞細胞增殖，且各藥物刺激組與常氧組相比也均有顯著性抑制作用。 4．免疫熒光照片可見，2％缺氧組與常氧組相比，熒光強度明顯增加，L-型鈣通道阻滯劑、細胞內Ca<'2+>螯合劑、CaM拮抗劑和NF-кB抑制劑均可顯著抑制缺氧誘導的細胞PCNA的表達量。 5．圖像分析顯示缺

11、氧對于HIF-1/2α、HIF-β的mRNA表達未見受缺氧和培養(yǎng)時間影響。常氧條件各時間點mRNA的表達量與在缺氧對應條件時間點下的表達量未見顯著差異，而且缺氧和常氧各自時間點間的表達差異也未見統(tǒng)計學差異。 6．常氧條件下，僅有微量HIF-1α蛋白表達，但因表達量很低無法進行統(tǒng)計分析。缺氧后，HIF-1α表達量大幅度增加，大約在48 h達到高峰，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，表達量急劇下降。常氧條件下，HIF-2α蛋白就有少量表達，缺氧后表

12、達量迅速達高峰，且其在缺氧12 h、24 h、48 h、72 h各個時間點表達量未見顯著差異。HIF-β無論是在缺氧還是在常氧條件下均可見大量表達，且表達量不隨培養(yǎng)時間的延長而改變；常氧和缺氧各個對應時間點之間其條帶的灰度值雖然有一定浮動，但是其差異也未見統(tǒng)計學顯著性。 7．常氧條件下，NFP、Amiloride、BAPTA/AM、CaM抑制劑TFP對于HIF-2αmRNA的表達未見顯著影響。與缺氧組不加藥物組相比，缺氧+Ami

13、loride、缺氧+BAPTA/AM、缺氧+TFP的HIF-2α mRNA的表達呈不同程度的抑制。 8．常氧條件下，NFP、Amiloride對HIF-2α的蛋白表達量未見明顯抑制作用，而BAPTA/AM、TFP對于HIF-2α的蛋白表達量呈顯著抑制作用。與常氧條件下相同，缺氧+BAPTA/AM、缺氧+TFP對于HIF-2α的蛋白表達呈顯著的抑制作用，NFP和Amiloride對于低氧條件下的PASMCs HIF-2α的表達影響

14、不明顯。 結論： 1．鈣信號參與調節(jié)缺氧引起的PASMCs增殖，其中CaM和NF-кB為兩個重要的調節(jié)點。 2．PASMCs的HIF-β的mRNA以及蛋白表達呈固有型表達特點，不受缺氧刺激所影響。 3．缺氧刺激后，PASMCs的HIF-1α、HIF-2α mRNA表達量未見顯著變化，而蛋白水平大幅度上升，其中HIF-1α蛋白約在48 h達到高峰，然后迅速回降，HIF-2α則在缺氧12 h后即達高峰并維持在